胶原蛋白体外自组装的流变学研究

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胶原蛋白是一种细胞外基质的结构蛋白,广泛存在于生物机体内。近年来,国内外学者对胶原蛋白的研究日益广泛和深入。由于其具有良好的生物可降解性、低免疫性、生物相容性等性能,胶原蛋白在食品工业、生物医学工程以及化妆品等领域得到了良好的应用。本研究以乌鳢皮ASC和PSC、草鱼皮PSC为原料,运用流变学的方法和原理,有针对性的开展淡水鱼胶原蛋白自组装过程的系统研究,全面的解析了淡水鱼胶原蛋白组装凝胶过程中流变学性能、机械性能、模量值的变化进程和不同条件因素、不同来源和种类的胶原对凝胶相关性能的影响,为进一步完善天然胶原体外自组装理论并为鱼胶原蛋白在生物医学材料中的开发与应用提供了具有价值的科学理论依据。采用浊度实验和黏弹实验相结合的方法初步研究了胶原蛋白在PBS的缓冲体系中的体外自组装行为。结果表明,胶原蛋白的自组装分为四阶段模式,即为初始阶段(成核段)、快速上升阶段、慢速上升段和平衡阶段。其中,快速上升阶段胶原蛋白弹性模量上升速率明显高于慢速阶段。在组装初期(初始阶段),胶原溶液表现为典型的流体性能,此时的粘性模量大于弹性模量,随着组装时间的延长,弹性模量和粘性模量都开始上升,但是弹性模量值增加更快并导致两种模量交汇点的出现。分别在不同的组装时间点测定自组装程度,实验结果表明,随着组装的时间延长,自组装程度也在上升,而自组装程度主要是反映新的胶原纤维的增加,说明新纤维的增加与胶原的弹性模量快速增长相关性不大。不同的组装时间点扫描电镜结果表明,三个测定时间点之间胶原纤维粒径的步差基本一致,胶原纤维的粒径增加主要发生在快速上升阶段。但是,粘弹实验的结果表明,在慢速上升阶段胶原体系模量值变化显著,当达到最终平衡时,其弹性模量几乎是快速上升段终点弹性模量的20倍。综合分析上述结果可以发现,在胶原自组装进程中,快速上升阶段是胶原分子有序聚集的胶原纤维的增长期,而慢速上升阶段则主要是胶原纤维的空间有序化排列并导致凝胶网格形成。胶原凝胶弹性模量迅速增加的最主要因素是胶原纤维的排布合理化程度进一步提高。不同频率条件下黏弹实验结果表明,随着频率的增加,弹性模量和粘性模量也随之增加并导致模量交汇点提前,而且发现模量的交汇点跟计算得出的凝胶时间点非常接近。透射电镜结果表明,胶原纤维是先横向增长再纵向增长,D周期在模量交汇点和达到第一个平衡阶段之间出现,并非与浊度同步。胶原微纤维的网格形成是在模量交汇点附近,大量的大纤维出现在模量达到第一个平衡阶段后,而且此时大纤维都已经形成网络。通过研究不同组装条件对胶原蛋白体外自组装的影响。结果表明,胶原蛋白的浓度越高,自组装速率越快,凝胶模量值越高;在变性温度范围内,其组装速度随着温度升高而升高,凝胶弹性模量和纤维粒径也同步增加;与Tris、水体系相比,PBS的缓冲体系对胶原自组装行为有显著的促进作用,说明磷酸根离子能促进胶原分子的聚集;体系离子强度对胶原组装有抑制作用,离子强度越大,抑制组装能力相差不大,弹性模量变化也不大;在选择的几种阳离子中,Ca2+对胶原蛋白的组装抑制能力最强;pH越高,胶原蛋白的自组装速度越快,组装速率越快,但是当pH大于10时,组装能力开始下降。以乌鳢皮ASC和PSC、草鱼皮PSC为原料,通过浊度实验和黏弹实验的方法比较了不同种类和来源的胶原蛋白的自组装行为。结果表明,ASC比PSC的组装速度要快,而且模量要大;在同一条件下,通过对乌鳢皮PSC和草鱼皮PSC自组装动力学的比较,乌鳢皮PSC的体外自组装速率快,模量大。
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