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乳腺癌(Breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤,是导致女性死亡的第二大癌症原因。近年来,随着肿瘤个体化治疗的不断发展,乳腺癌患者的预后得到很大改善。但是,肿瘤的复发和患者的耐药已成为困扰临床治疗的另一难题。抗人类表皮生长因子受体2(HER2)靶向治疗药物——曲妥珠单抗(又称赫赛汀)是临床治疗HER2扩增型乳腺癌的一线药物。但是,其最终耐药率高达65%,这其中包括70%的患者在治疗初期对曲妥珠单抗治疗敏感,最终也获得耐药性。因此,研究发现一些预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗的耐药性的可靠生物学指标以及患者预后的预测因子势在必行,旨在更好的指导临床选择个体化治疗方案,及阐明乳腺癌患者获得耐药的潜在分子机制,为二线疗法与药物的研发提供理论依据。Hippo通路是近年来新发现的肿瘤相关信号转导通路,其通过调节细胞的凋亡和增殖,在维持组织器官大小及肿瘤发生发展中起着重要的作用。Yesassociated protein(YAP)蛋白是Hippo通路的下游效应因子,是一种转录共激活因子,而且YAP蛋白在多种人类肿瘤中都存在不同程度的表达。YAP蛋白与不同的转录因子相互作用,决定其在肿瘤生物学中发挥不同的生物学作用。目前,YAP在肿瘤发生发展中的作用尚无一致性结论。一些研究结果表明YAP蛋白表达与肿瘤进展、患者低生存率存在显著相关性,并且细胞核内的YAP蛋白与其他转录因子相互作用,促进肿瘤细胞增殖、转移和干性的维持。因此,YAP被认定为是癌基因和潜在的治疗靶点。然而,近年来的一些研究表明YAP蛋白是一种肿瘤抑制因子,可以抑制肿瘤的发生,参与促进细胞凋亡,并抑制肿瘤细胞干性的维持和炎症活动。实验方法:本研究拟通过免疫组织化学、CCK8、蛋白免疫印迹、实时定量PCR、流式细胞术等实验方法,结合sh RNA干扰与选择性抑制剂系统地分析了YAP在乳腺癌临床样本和乳腺癌细胞株中的表达情况及其临床意义,并进一步阐明YAP对HER2扩增型乳腺癌曲妥珠单抗治疗耐药的影响和相关机制。实验结果如下:1.乳腺浸润性导管癌(IDC)患者样本中YAP蛋白表达与孕激素受体(PR)蛋白表达呈显著正相关;与HER2蛋白表达、Ki67增殖指数以及淋巴结转移呈显著负相关。YAP蛋白在不同的乳腺癌分子亚型中的表达率存在着显著差异,其中在Luminal A型中阳性率最高(73.8%),在HER2扩增型乳腺癌中阳性率最低(37.5%)。2.单因素生存分析表明:YAP蛋白阳性的Luminal A型乳腺癌患者的无进展生存期(DFS)(P=0.001)与总生存期(OS)(P=0.005),相比于YAP蛋白阴性患者的更长;YAP蛋白阳性的乳腺IDC、Luminal B(HER2-)型以及Luminal B(HER2+)型乳腺癌患者的DFS,相比于YAP蛋白阴性患者的更长(P=0.009)。多因素生存分析表明:年龄(HR:0.573,95%CI:0.337~0.975,P=0.040)、p TNM分期(HR:2.193,95%CI:1.024~4.697,P=0.043)以及YAP蛋白表达(HR:0.547,95%CI:0.32~0.934,P=0.027)可以作为IDC患者DFS的独立预测因素;PR蛋白表达(HR:0.073,95%CI:0.012~0.443,P=0.004)可以作为IDC患者OS的独立预测因素。3.YAP蛋白在曲妥珠单抗治疗敏感细胞株BT474-TS(Trastuzumab sensitive)细胞与曲妥珠单抗治疗耐药细胞株BT474-TR(Trastuzumab resistant)细胞中的均有表达,但总蛋白表达量并无显著差异。在经曲妥珠单抗治疗后,BT474-TS细胞中YAP蛋白细胞核蛋白表达量显著增高;BT474-TR细胞经治疗后,YAP蛋白细胞核蛋白表达量则显著降低。4.BT474-TS细胞在经曲妥珠单抗治疗后,p-AKT蛋白表达量显著降低;而BT474-TR细胞在经曲妥珠单抗治疗后,p-AKT蛋白表达量则显著升高。5.通过sh RNA沉默BT474-TS细胞中YAP基因表达后,曲妥珠单抗对沉默组BT474-TS细胞的抑制作用显著减弱;与空载组相比,沉默组经曲妥珠单抗治疗后p73的表达量显著降低;沉默组中曲妥珠单抗治疗24小时肿瘤细胞凋亡减少;并且cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP表达量显著降低。6.与BT474-TR细胞不加药对照组和单独药物治疗组相比,曲妥珠单抗与GSK690693(AKT抑制剂)联合治疗对BT474-TR细胞的抑制作用显著升高;肿瘤细胞凋亡增加、cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP表达量显著升高YAP蛋白细胞核表达量显著升高、p73表达量显著升高。7.接受紫杉醇、多柔比星联合环磷酰胺(TAC)方案新辅助化疗或多西他赛、卡铂联合曲妥珠单抗(TCb H)方案新辅助化疗乳腺癌患者的治疗前活检组织样本中YAP蛋白表达与p73蛋白表达呈显著正相关(P=0.049,P=0.010)、与p-AKT蛋白表达呈显著负相关(P=0.016,P<0.001);在TCb H方案治疗后手术样本中YAP蛋白表达与p73蛋白表达呈正相关(P=0.002),在TAC方案和TCb H方案治疗后手术样本中YAP蛋白表达与p-AKT蛋白表达均呈负相关(P=0.001,P=0.002)。TAC方案治疗后手术样本与治疗前样本相比p-AKT蛋白的表达显著降低(P=0.010)。8.接受TAC方案新辅助化疗和接受TCb H方案新辅助化疗乳腺癌患者的p CR率都与化疗前样本中p-AKT蛋白表达呈显著负相关(P=0.005,P=0.018);TCb H方案治疗前活检样本中YAP蛋白表达和p73蛋白表达均与患者的p CR率呈正相关(P=0.018,P=0.040)。本实验结论:1.YAP蛋白高表达可以作为乳腺癌患者预后良好的独立预后预测因子,尤其是对Luminal A型乳腺癌患者的预后预测。2.YAP蛋白与p-AKT蛋白表达可以做为乳腺癌患者新辅助化疗疗效的预测因子。3.乳腺癌细胞中AKT的异常活化,抑制了YAP-p73诱导的细胞凋亡,削弱了曲妥珠单抗对肿瘤细胞的抑制作用,导致肿瘤细胞获得对曲妥珠单抗的耐药性。