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目的1.建立一种简单、灵敏、经济的以PVDF膜为载体的染料结合法(PVDF膜-染料结合法)测定尿液中的微量清蛋白。2.建立一种简单、快速的体积排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)测定尿液中的微量清蛋白。方法1. PVDF膜-染料结合法：于PVDF膜上先加甲醇,再加清蛋白标准品和待测尿液样本,用考马斯亮蓝染色液进行染色,脱色、干燥后膜上形成样本斑点。用凝胶成像系统进行斑点密度扫描,制作斑点密度-清蛋白标准品浓度标准曲线,再计算出待测尿样本中清蛋白的浓度。2. SE-HPLC法：清蛋白标准液或尿液样本200μL与0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)400μ漩涡混匀后,自动进样20μL分析测定；色谱柱为分子筛Agilent Zorbax GF-250柱(250mm×4.6mmi.d,4 um)；流动相：溶剂A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,溶剂B为乙腈,溶剂A与溶剂B体积比为85:15；流速为1.0 ml/min;柱温为30℃；检测波长为205nm；用外标法测定峰面积对尿液微量清蛋白进行定量分析。结果1. PVDF膜-染料结合法：批内和批间CV分别为9.1%和10.0%(50 mg/L)、5.6%和9.6%(100 mg/L)及5.0%和7.4%(200 mg/L)。对63例待检样本进行检测,免疫速率散射比浊法和PVDF膜-染料结合法的检测结果均值分别为179.30±187.01 mg/L和237.63±157.81mg/L,两法有良好的相关性(r2=0.8552),但PVDF膜-染料结合法结果高于免疫速率散射比浊法(P=0.000)。方法的检测低限为15mg/L,线性范围可达600 mg/L。Hb、胆红素、IgG对方法有正干扰。尿液pH值对结果无显著性影响。用PVDF膜比用醋酸纤维素膜检测尿中清蛋白有更高的灵敏度。2. SE-HPLC法：清蛋白保留时间约为1.73 min,批内和批间CV分别为3.98%和4.05%(20 mg/L)、3.55%和3.60%(200 mg/L)及4.65%和4.74%(2000 mg/L),平均回收率为99.2%。SE-HPLC法与免疫速率散射比浊法比较,其检测结果均值在正常清蛋白尿组分别为40.0±24.6 mg/L、8.4±4.3 mg/L(P=0.000；n=40),在微量清蛋白尿组分别为260.2±138.8 mg/L、57.9±37.3 mg/L(P=0.000；n=30),在蛋白尿组分别为1127.9±622.1 mg/L、1212.7±696.3 mg/L(P=0.001；n=30)。前两组SE-HPLC法检测结果明显高于免疫速率散射比浊法,而在蛋白尿组SE-HPLC法检测结果比免疫速率散射比浊法低约7%。SE-HPLC法的检测低限为2mg/L,2000 mg/L浓度范围内线性良好r2=0.9969)结论1.本研究建立了一种PVDF膜-染料结合法检测尿液微量清蛋白浓度,该方法精密度高,操作简便,成本低廉,灵敏度高,是一种经济简便的尿液清蛋白检测方法,适用于MAU的快速筛查。2.本研究建立了一种SE-HPLC法检测尿液微量清蛋白浓度,该方法精密度、准确度、回收率、检测低限、线性范围等指标均符合诊断试验的要求,尤其是流动相配制简单,清蛋白保留时间短,具有简单、快速、灵敏的特点,可以实现大批量的自动检测,适用于临床常规定量检测尿液微量清蛋白。