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油菜属于十字花科芸薹属植物,同时也是我国和世界上最重要的油料作物之一。本研究采用RNA干扰技术,通过两种不同的路径提高油菜籽的含油量:(1)由于AP2基因是油脂合成的负调控因子,因此抑制AP2基因的表达,将有利于油脂在菜籽中的积累;(2)利用油菜籽发育过程中蛋白质与油脂积累成负相关的原理,通过抑制Napin和Cruciferin基因的表达,降低油菜种子中的储藏蛋白含量,进而提高菜籽的含油量。依照上述思路,本文将 pCambia 2300-35S-NPT Ⅱ-napin promoter-AP2 RNAi载体质粒通过农杆菌介导的遗传转化转入甘蓝型油菜中,同时将pCambia 2300-35S-NPT Ⅱ-napin-promoter-napin-cruciferin RNAi 载体质粒与 pCambia 2300-PKA-napin promoter-AP2 RNAi载体质粒以共转化的方式转入受体甘蓝型油菜中。随后,对转基因后代植株进行了分子鉴定,同时分析了转基因后代植株AP2基因、Napin基因和Cruciferin基因表达的变化及其对转基因后代植株的千粒重、蛋白质含量、含油量、喙长等的影响,为后续工作奠定了理论基础。主要研究结果包括:1.通过农杆菌介导的子叶柄遗传转化方法,将带有种子特异性Napin启动子的植物表达载体转入甘蓝型油菜受体材料,通过PCR对NPTⅡ或PKA标记基因的鉴定,筛选出带有不同植物表达载体的转基因植株。为方便叙述,本文将能检测出NPT Ⅱ 标记基因的 pCambia 2300-35S-NPTⅡ-napin promoter-AP2 RNAi 干扰材料命名为 BnAP2a 植株;将 pCambia 2300-35S-NPTⅡ-napin-promoter-napin-cruciferin RNAi 载体质粒与 pCambi a 2300-PKA-napin promoter-AP2 RNAi 共转化后仅能检测出PKA标记基因的AP2基因干扰材料命名为BnAP2b植株,仅能检测出NPTⅡ标记基因的Napin与Cruciferin基因干扰材料命名为BnNC植株,能同时检测出NPT Ⅱ与PKA标记基因的AP2、Napin、Cruciferin基因干扰材料命名为BnANC植株。在4468株T1代油菜转基因植株中,共鉴定出86株BnAP2a植株,146株BnAP2b植株,50株BnNC植株,346株BnANC植株;在564株T2代油菜转基因植株中,共鉴定出36株BnAP2a植株,24株BnAP2b植株,152株BnNC植株以及3株BnANC植株。2.对授粉后10天、15天和20天野生型植株的胚进行荧光定量PCR分析,发现AP2基因在授粉后第10天表达量最高,Cruciferin基因在授粉后15天表达量最高,Napin基因在授粉后20天表达量最高。3.比较了 T1代转基因植株和野生型植株的胚中基因表达的差异,发现在转基因植株中,AP2、Napin和Cruciferin基因的表达模式与野生型植株中的表达模式类似,但表达量较野生型植株有不同程度的下调。4.利用荧光定量PCR分析野生型植株与T1代转基因植株的胚中AP2基因的表达,发现2株材料中AP2基因的表达存在不同程度的抑制。对于AP2a-2-21(NPT),在10DAP,15DAP,20DAP,AP2基因的表达抑制效果分别为34.02%,46.06%,11.67%;对于 ANC-6-8(NPT/PKA),在 10DAP,15DAP,20DAP,AP2 基因的表达抑制效果分别为76.2%,65.62%,54.93%;5.利用荧光定量PCR分析野生型植株与T1代转基因植株的胚中Napin与Cruciferin基因的表达,发现4株材料中Napin和Cruciferin基因的表达存在不同程度的抑制。对于NC-1-21(NPT),在15DAP,Cruciferin基因的表达抑制效果为59.4%;在20DAP,Napin基因的表达抑制效果为71.08%;对于NC-86-L10(NPT),在15DAP,Cruciferin基因的表达抑制效果为61.39%,在20DAP,Napin基因的表达抑制效果为 97.18%;对于 ANC-6-8(NPT/PKA),在 15DAP,Cruciferin 基因的表达抑制效果为20.44%,在20DAP,Napin基因的表达抑制效果为28.3%;对于ANC-36-8(NPT/PKA),在15DAP,Cruciferin基因的表达抑制效果为40.54%,在20DAP,Napin基因的表达抑制效果为91.98%。4.在247株T2代转基因油菜中,有57株转基因油菜(9株BnAP2a植株,15株BnAP2b植株,4株BnNC植株,29株BnANC植株)含油量与野生型植株差异显著,平均提高了 6.53个百分点,相对提高了 17.38%;66株转基因油菜(20株BnAP2a植株,14株BnAP2b植株,11株BnNC植株,21株BnANC植株)蛋白质含量与野生型植株差异显著,平均降低了 4.25个百分点,相对降低了14.39%;15株转基因油菜(3株BnAP2a植株,4株BnAP2b植株,8株BnANC植株)千粒重与野生型植株差异显著,平均增加了 1.38g,相对提高了 36.6%;30株转基因油菜(5株BnAP2a植株,2株BnAP2b植株,4株BnNC植株,19株BnANC植株)喙长与非转基因植株差异显著,平均增加了 0.52cm,相对增加了40.9%。5.对247株T2代转基因植株种子的含油量与考种数据进行相关性分析,发现含油量与蛋白质含量、千粒重和喙长呈显著相关,相关性系数分别为-0.786,0.23和0.246。荚果长度与每果粒数与含油量间并无显著相关性。6.比较了转基因与非转基因植株基因表达的改变与含油量等性状间的关系,发现AP2基因表达的下调可能导致含油量和千粒重的提高;而Napin和Cruciferin基因表达的下调可能导致含油量的提高及蛋白质含量的降低。7.在BnAP2a植株中,部分编号的花瓣表现出不育的性状,荚果长度明显短于野生型植株,叶色深绿,这些性状与目的基因的关系仍有待进一步的研究。