【摘 要】
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恩诺沙星(enrofloxacin)是一个动物专用的氟喹诺酮类药物.由于广泛应用于兽医临床,该药在动物食品中的残留问题已引起了人们的高度重视.为了研制恩诺沙星残留快速检测试剂盒,
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恩诺沙星(enrofloxacin)是一个动物专用的氟喹诺酮类药物.由于广泛应用于兽医临床,该药在动物食品中的残留问题已引起了人们的高度重视.为了研制恩诺沙星残留快速检测试剂盒,我们制备了恩诺沙星的单克隆抗体,研究了其ELISA检测方法,为试剂盒的研制打下了基础.实验采用碳二亚胺法和氯甲酸异丁酯法(又称混合酸酐法)分别合成恩诺沙星的人工免疫原(ENR-BSA)和包被原(ENR-OVA).透析后,用FeCl<,3>显色反应、紫外扫描分析和SDS-PAGE电泳对人工抗原进行确认.FeCl<,3>显色反应显示:透析后反应物与FeCl<,3>呈橙黄色略显浑浊,透析外液与FeCl<,3>则显浅黄色;紫外扫描图谱显示:透析彻底的反应物在λ323.00nm处有一吸收峰,与单纯BSA的图谱不同,但与单独恩诺沙星图谱的特征峰相似;SDS-PAGE电泳图谱显示:反应物所跑出的条带位置明显滞后于单纯的BSA条带.三种鉴定方法均提示恩诺沙星人工抗原合成成功,ENR-BSA的交联比约为15:1,ENR-OVA的交联比约为9:1.按照不同的免疫剂量,将不同方式合成的两种ENR-BSA与等量的弗氏完全或不完全佐剂乳化,采用腹腔免疫方式免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测表明,三免后小鼠抗血清的效价都可达1:100000以上;间接竞争ELISA检测表明,游离的ENR可以与包被原竞争性的结合抗血清,有明显的抑制效果,表明抗血清中有针对ENR的特异性抗体存在.利用细胞融合技术,用50%PEG将骨髓瘤SP2/0细胞和免疫小鼠的脾细胞进行融合,间接ELISA和间接竞争ELISA筛选特异性抗体,有限稀释法克隆细胞,3次亚克隆后,获得10株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株.利用活酯法合成酶标记半抗原(ENR-HRP),透析后,用紫外扫描分析和直接ELISA方法对酶标记半抗原进行确认.紫外扫描图谱显示:透析彻底的反应物在λ271.00nm处有一吸收峰,与单独HRP的图谱不同,但与恩诺沙星的特征峰相似;包被抗体的直接ELISA反应显示一定的效价滴度,表明ENR-HRP合成成功,其结合比约为1.6:1.选择ENR-HRP与游离ENR相竞争的模式建立检测ENR残留的ELISA检测方法,其最佳工作条件为:二抗的包被浓度为2μg/mL,抗体工作浓度1:1000,酶标半抗原工作浓度1:500.
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