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肠道生长是仔猪生长发育的核心和快速生长的基础,而氨基酸是肠道优先利用的重要营养物质,对肠道生长发育发挥重要的作用。哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)是细胞内重要的信号调控分子,能整合氨基酸和能量感应通路,进而调控细胞存活与代谢。前期研究证实,精氨酸(Arg)能激活肠上皮细胞mTOR信号通路,促进细胞增殖和损伤修复。但是,mTOR在肠上皮细胞对精氨酸利用及其损伤修复过程的能量感应机制尚不清晰。因此,本文研究mTOR信号通路调控猪肠上皮细胞细胞增殖、Arg利用和能量代谢的作用及其机制,旨在阐明仔猪肠道氨基酸营养感应机制,为肠道生长发育调控提供重要的理论基础。 (1)体外培养猪肠上皮细胞IPEC-1,利用雷帕霉素(Rap)抑制mTOR,分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡以及PI3K-Akt-mTOR和凋亡通路蛋白质表达水平。结果表明,抑制mTOR信号通路能显著抑制猪肠上皮细胞周期,减少S期细胞比例,而提高Arg浓度能缓解Rap对细胞增殖的抑制作用(P<0.05);Rap降低了细胞凋亡率和细胞凋亡蛋白表达量,但提高了抗细胞凋亡蛋白的表达量;Rap抑制了PI3K-Akt-mTOR通路,而提高Arg浓度可缓解Rap对PI3K-Akt-mTOR通路的抑制。 (2)不同浓度Arg培养猪肠上皮细胞IPEC1和IPEC-J2,利用Rap抑制mTOR,分别检测猪肠上皮细胞Arg摄取率、转运载体表达量的mRNA和蛋白水平以及Arg分解代谢相关蛋白表达水平。结果表明,Rap促进了Arg的摄取,促进了100μMArg培养的细胞中转运载体CAT2的表达(P<0.05);抑制Arg代谢相关酶ArginaseⅠ和ArginaseⅡ的表达,但是却促进了iNOS的表达,提高了NO的生成(P<0.05);迸一步证明Rap可能通过PKCα-Erk/cFos-CAT2通路调控CAT2表达,从而促进精氨酸的摄取。 (3)不同比例氨基酸培养猪肠上皮细胞或不同浓度Arg培养猪肠上皮细胞且利用Rap抑制mTOR,检测细胞呼吸代谢以及能量代谢相关产物和信号通路蛋白表达。结果显示,随着总氨基酸的比例升高,细胞呼吸代谢增高,相应的三羧酸循环代谢物也升高,mTOR通路被激活的程度也不断增加;4h后,随着总氨基酸的比例升高,AMPK通路逐渐被抑制。抑制mTOR通路后,呼吸代谢被抑制,显著降低糖酵解过程相关激酶表达量以及ROS的生成(P<0.05);代谢组学结果显示,Rap显著降低细胞内丙氨酸、柠檬酸、胆碱、肌醇和苏氨酸含量,而提高亮氨酸、β-羟基异丁酸、精氨酸、赖氨酸、醋酸、糖蛋白和甲酸含量(P<0.05)。 (4)抑制mTOR和AMPK或者激活AMPK通路培养猪肠上皮细胞IPEC-J2,检测呼吸代谢以及能量代谢相关产物和相关信号通路表达。抑制mTOR和AMPK通路均能显著抑制细胞呼吸代谢,相应三羧酸循环代谢物的含量降低,且降低糖酵解作用(P<0.05);抑制AMPK通路可能促进脂质代谢,激活AMPK影响糖酵解作用和三羧酸循环的代谢产物;AMPK和mTOR通路相互抑制;激活AMPK通路主要调控mTOR通路上游相关基因。 上述研究结果提示,抑制mTOR信号通路显著抑制猪肠上皮细胞增殖,可能通过调控PKCα-Erk/cFos-CAT2通路促进细胞对精氨酸的摄取;抑制mTOR信号通路抑制精氨酸酶代谢相关酶表达,促进Arg-NO通路,降低细胞线粒体呼吸代谢和能量代谢;mTOR与AMPK相互调控感应细胞的能量代谢。说明mTOR信号通路在肠上皮细胞精氨酸利用和能量代谢过程中发挥重要作用。结果为仔猪肠道氨基酸营养调控和生长发育调控提供理论依据,对提高氨基酸利用率、促进肠道健康具有重要意义。