生命体生长发育需要氮。人工固氮会造成多种环境问题,而生物固氮更高效环保。豆科植物根瘤共生固氮体系（NFS）是最主要也是最突出的生物固氮。当根瘤菌侵染宿主植物后,会引起根表皮细胞细胞核周围Ca²⁺发生震荡。这种震荡产生的信号需要依赖钙/钙调素蛋白激酶（CCaMK）解码。CCaMK只有在机体内的Ca²⁺浓度发生变化且同时有钙调素（CaM）存在时才会被激活并参与调控NFS形成。植物中广泛存在CaMs多基因家族并编码不同的蛋白亚型,且不同的CaMs蛋白具有不同的生物学特性和功能。因此,本研究以百脉根（Lotus japonicus（Regel）K.Larsen）的钙调素家族蛋白为研究对象,探讨其体外生物学活性的多样性。主要实验结果如下:1)通过定点突变技术获得CCaMK与ccamk-14条带并构建其原核表达载体。用1 mmol/L的IPTG在28°C进行诱导表达,上清中存在一条与理论值大小相符的特异蛋白条带（57 kDa左右）,表明在该温度下成功表达。收集菌体超声破碎,离心后取上清纯化,使用BCA试剂盒测定纯化后的蛋白浓度,CCaMK为415.1μg/mL,CCaMK^S337N为474.7μg/mL。2)1 mmol/L IPTG、37°C、9 h表达pET28-a（+）-LjCaMs并纯化。发现不同的LjCaMs被EGTA完全洗脱的浓度以及与Ca²⁺的结合能力均不相同。当纯化后LjCaMs为9μg时,采用50μL的反应体系,发现LjCaM1和LjCaM3能被0.1μmol的EGTA完全洗脱,LjCaM2被0.05μmol的EGTA完全洗脱,而LjCaM4在EGTA达到0.2μmol时才能被完全洗脱。此外,完全洗脱后的LjCaMs结合Ca²⁺的能力也不一致。当LjCaMs为9μg时,采用50μL的反应体系,发现LjCaM1在Ca²⁺为1.25μmol时便达到饱和,LjCaM2在Ca²⁺为1.4μmol时达到饱和,LjCaM3在Ca²⁺为2.5μmol时还未达到饱和,而LjCaM4在Ca²⁺浓度为2μmol时达到饱和。因此,各个LjCaMs完全结合Ca²⁺的能力大小为LjCaM3>LjCaM4>LjCaM2>LjCaM1。3)将LjCaMs与CCaMK/CCaMK^S337N进行体外互作检测,结果表明利用原核表达的重组蛋白CCaMK/CCaMK^S337N不能直接与LjCaMs互作。猜测可能是因为反应缓冲液中的Ca²⁺浓度不足或是CCaMK未磷酸化,需要加大反应缓冲液中的Ca²⁺浓度以及将CCaMK磷酸化后再进一步实验。4)在拟南芥原生质体中进行LjCaMs与CCaMK和ccamk-14的双分子荧光互补检测。证明LjCaMs与CCaMK、CCaMK^S337N均能相互作用。LjCaM1与CCaMK互作后的结合蛋白主要分布在原生质体的质膜上,在细胞质上存在少量分布,LjCaM2与CCaMK互作后的结合蛋白在原生质体的质膜、叶绿体膜、细胞核以及细胞质上都有分布,和LjCaM3与CCaMK互作后的结合蛋白在原生质体的质膜及细胞质上都有分布,而LjCaM4与CCaMK互作后的结合蛋白分布在原生质体的质膜以及叶绿体膜上;而LjCaM1和LjCaM4与CCaMK^S337N的相互作用发生在质膜和细胞质中;LjCaM2与CCaMK^S337N的相互作用发生在质膜、叶绿体膜及细胞质上;LjCaM3与CCaMK^S337N的相互作用发生在质膜、细胞质和细胞核中。这说明了CCaMK^S337N的突变会影响其与钙调素的结合。