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鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)是由鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease0fdeer virus,EHDV)引起的一种致死性动物虫媒病,其发病特征为引起白尾鹿体温升高、黏膜和浆膜面广泛出血并常处于昏迷状态,最终导致死亡。有记载在日本己从牛体内分离到EHDV,一些非洲国家也曾有爆发牛和绵羊EHD疫情的报道。由于EHD危害较大,死亡率高达90％,严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展,虽然我国大陆目前还没有EHD的报道,但由于EHDV已存在于周边国家和地区(如日本、朝鲜和我国台湾省),存在EHDV传入我国大陆的风险,属于我国进出口动物贸易中重点检疫的疫病之一。本研究采用基因工程表达鹿流行性出血病病毒群特异性抗原,免疫学技术制备单克隆抗体,在此基础上研制出鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)快速诊断试剂盒。
根据GenBank公布的EHDV VP7基因序列,设计VP7特异引物,通过RT-PCR从EHDV基因组中扩增VP7基因,构建pBAD-EHDV VP7表达载体,转化LMG194E.coli细胞进行蛋白表达,通过对表达条件的优化、SDS-PAGE、Western blot分析,结果表明所表达的VP7蛋白可以与EHDV多克隆抗体发生特异性反应。
用纯化的EHDV-1与弗氏佐剂乳化后,免疫6周龄BALB/c小鼠。分离免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经EHDV-ELISA、EHDV VP7-ELISA和BHK-ELISA筛选,得到了2株(1A5和8H6)可以稳定分泌抗EHDV VP7特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株单克隆抗体与其它相关病毒无交叉反应,2株单克隆抗体(腹水)的ELISA效价分别为1:1024000和1:2048000,亲和常数分别为4.1×108L/mol和5.5×108L/mol。
用原核表达的EHDV VP7蛋白作为抗原,包被ELISA板,用抗EHDV VP7蛋白的特异性单克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(c-ELISA)检测方法。用c-ELISA检测EHDV阳性血清及其它病毒阳性血清,结果表明该方法具有良好的特异性,与其它相关病毒抗血清无交叉反应。用该c-ELISA方法和琼脂扩散试验(AGID)同时检测系列稀释的EHDV阳性血清,结果表明,c-EIASA的检测极限相当于AGID方法检测极限1/4～1/16。用c-ELISA检测阳性样品和阴性样品各50份(AGID检测结果),结果表明该c-ELISA的特异性和敏感性分别是96.0%和92.0%,两种方法检测结果的符合率为94.0%。本研究建立的c-ELISA特异性和敏感性都比AGID高,因此,该方法可用于EHDV血清流行病学调查,该方法的建立也为我国研究鹿流行性出血病提供了技术储备,对防止该病传入我国大陆具有重要的现实意义。