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为了研究生长素(Ghrelin,GHRL)基因影响家禽脂肪沉积的遗传机制,本试验选择鸡和鸭为研究对象.从DNA水平的多态性,mRNA和蛋白水平的表达差异以及细胞水平的干预实验,证实鸡和鸭的GHRL及其受体(Growth Homone Secretagogue Receptor,GHSR)基因对脂肪沉积的影响,并从比较生物学角度对鸡和鸭,以及其他物种的研究结果,阐述两基因在皮下脂肪和腹部脂肪沉积中作用的异同.
本试验克隆了鸭GHRL及其受体基因序列,获得鸭的GHRL基因cDNA长835bp,包括编码区466bp和5UTR(115bp)、3UTR(258bp),编码合成116个氨基酸的多肽;其基因全长2872bp,包含5个外显子和4个内含子.获得鸭GHSR基因DNA部分序列(3717bp),由两个外显子和一个内含子组成:外显子1长591bp(不全),外显子2长148bp(不全),内含子全长2978bp.
选择杏花鸡、隐性白洛克鸡、丝羽乌骨鸡、来航鸡、三水白鸭、北京鸭、麻鸭、水鸭等8个品种对鸡和鸭的GHRL和GHSR基因进行SNP(单核苷酸多态性)筛查,结果共获得鸭GHRL基因全基因变异共42个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Ploymorphisms,SNPs),1个微卫星和1个9 bp插入缺失;获得鸭GHSR基因48个SNPs和5个插入缺失;获得鸡GHRL基因5侧翼区变异17个SNPs和1个polyA;获得鸡GHSR基因5侧翼区变异共21个SNPs和3个插入缺失.
利用华南农业大学杏花鸡×隐性白洛克鸡F2资源群和三水白鸭随机群体分析部分突变位点与脂肪及生长性状的相关性.结果表明:(1)对鸭GHRL基因C-729T、C985T及其单倍型分析表明,其与21日龄体重、28日龄体重、宰前活重(49日龄)、皮下脂肪厚显著相关或极显著相关(P<0.05);(2)对鸭的GHSR基因的T404C、C3427T及其单倍型分析与单个SNP分析的结果是与宰前活重、半净膛重、皮下脂肪厚显著相关或极显著相关(P<0.05);(3)对鸡GHRL基因C-2030T、C-2047G、A-2220C、A-2246G、A-2355C、C-2399-和单倍型分析结果,对单个SNP分析的结果是只与部分性状显著相关,但单倍型的分析结果是与绝大部分的生长性状和屠体性状显著相关或极显著相关(P<0.05),但与腺胃mRNA和血清活性蛋白量相关性并不显著.(4)鸡的GHSR基因C-1456T和A-1022C单个点和单倍型的分析结果均与生长或屠体性状均没有显著相关.(5)对鸡GHRL基因5调控区的A-2220C位点进行凝胶阻滞电泳,发现含A等位基因的DNA片段与转录因子(核蛋白)有结合,含C等位基因的DNA片段与转录因子没有结合.标记与性状的相关分析结果也显示,AA基因型的mRNA确实较高,活性蛋白的水平也比较高,性状优势也比较明显.可见A等位基因可能与转录因子AP-1有结合,能够促进GHRL基因的表达. 检测高脂肪沉积的速生型岭南黄鸡和三水白鸭,以及低脂肪沉积的胡须鸡和麻鸭不同组织中的GHRL和GHSR基因的mRNA表达量,通过比较结果显示:(1)鸡和鸭GHRL的mRNA均是在腺胃表达量最高,高脂肪沉积的腺胃表达量明显高于低脂肪沉积型.(2)GHSR基因在鸡和鸭的许多组织都有表达,其中鸭的GHSR脑部组织表达量较高,脂肪组织,睾丸、卵巢、小肠也有表达,而且皮脂的表量高于腹脂.从高脂肪沉积的三水白鸭和低脂肪沉积的麻鸭表达量间的比较看:高脂肪沉积的睾丸和小丘脑表达量明显高于低脂肪沉积型；垂体和皮脂的表达量明显低于低脂肪沉积型.鸡的GHSR基因在胸肌、腿肌的表达量较高.快大型肉鸡和矮小型地方品种的表达量-间的比较看:高脂肪沉积的快大型岭南黄鸡在外围组织如肺、肝、脾、肾、腺胃、卵巢、输卵管等组织的表达量高于低脂肪沉积的胡须鸡；在垂体、大脑、下丘脑等中枢组织表达量低于低脂肪沉积的胡须鸡.
分离培养鸡和鸭的皮下和腹部的前脂肪细胞,用鸡的GHRL活性蛋白进行干预,分析不同浓度的GHRL对前脂肪细胞增殖过程的影响,结果表明以不同浓度的GHRL分别刺激鸡和鸭的腹部前脂细胞和皮下前脂肪细胞,基本上所有浓度均能促进细胞增殖,这种作用并没有呈现剂量依赖性,高浓度的GHRL刺激反而对前脂肪细胞的促增殖作用有所下降.(2)从腹部前脂细胞和皮下前脂肪细胞的比较看,低剂量、短时间内GHRL更有利于促进鸭皮下前脂肪细胞和鸡腹部前脂肪细胞的增长.
综上,GHRL基因是家禽脂肪沉积的重要候选基因,GHSR基因对家禽皮下脂肪沉积具有重要作用.GHRL及其受体GHSR基因对家禽脂肪沉积具有促进作用,GHRL能优先增加鸡腹部脂肪摄取和促进腹部脂肪合成,增加鸭皮下脂肪的摄取和促进皮下脂肪的合成,对皮脂和腹脂的沉积具有种间特异.