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干扰素(Interferon,IFN)是一种广谱抗病毒糖蛋白,它是1957年由英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann,在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时发现,并将其命名为干扰素。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构的不同,可将干扰素划分为IFN-α,IFN-β,IFN-γ。其中又根据其对酸的不同敏感性,分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素。Ⅰ型干扰素对酸的耐受性较大,分别有IFN-α,IFN-β,IFN-ω,IFN-δ,IFN-κ,IFN-τ6种类型,Ⅱ型干扰素对酸敏感,迄今为止只有IFN-γ一个成员。Β干扰素(IFN-β)主要由成纤维细胞产生具有诱导细胞产生多种抗病毒蛋白、刺激NK细胞并增强其杀伤功能、增加抗原提呈细胞MHC Ⅰ类分子(主要组织相容性复合物Ⅰ)表达、增强吞噬细胞的活力。
自干扰素被发现以来,人们即对其临床应用寄托以极大希望,特别是干扰素除能诱导抗病毒活性外,还能调节免疫应答和增强抗肿瘤活性。本实验通过对猪β干扰素基因的改造、克隆和表达,旨在获得具有高表达量的菌株,并比较基因改造前后表达菌的表达活性和蛋白活性。
本实验首先通过NCBI数据库获得猪β干扰素基因的全序列,根据毕赤酵母密码子的偏嗜性,在保留编码蛋白序列的同时对猪β干扰素基因进行改造,在上游序列加入限制性酶Kpn I识别位点,去掉IFN-β基因原有的信号肽和起始密码子,并增加一个对框碱基,以调整猪β干扰素基因和其融合的载体序列的阅读框正确；在下游序列加入限制性酶Xba I识别位点,并保留了原有的终止密码子。为进行目的蛋白的分泌表达,本实验采用了毕赤酵母表达载体的α因子信号肽。此信号肽能引导目的蛋白离开细胞,分泌到培养基中,方便蛋白质提取与纯化。
对PoIFN-β基因进行毕赤酵母偏嗜性改造,使基因序列G+C的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA。构建了酵母表达载体pPICZαC-PIB。pPICZαC-PIB经Sac I酶切线性化后电转导入毕赤酵母菌株X-33。对PCR鉴定为阳性的酵母菌株进行高抗性筛选,获得一株高效表达PoIFN-β酵母菌株,其表达量约为258.3μg/mL,是未经密码子改造菌株表达产物的3.4倍。表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting检测,表明表达产物是分子量约为22kDa和24kDa的蛋白,两者均可与抗PoIFN-β阳性血清发生特异反应。将表达产物进行氨基酸测序,测得两段随机肽段与PoIFN-β的氨基酸序列完全一致。在VSV-Vero系统上检测重组PoIFN-β对水泡性口炎病毒在Vero细胞中增殖的抑制作用,其抗病毒活性为1.88×106IU/L,是未经密码子改造菌株表达产物抗病毒活性的5.6倍。用MTT法检测PoIFN-β对猪外周血淋巴细胞成熟的影响,结果表明,猪重组PoIFN-β能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性。将猪瘟疫苗与40万单位干扰素联合使用,可以更好的保持猪瘟抗体水平,缓和抗体水平的下降,对猪只起到一定的保护作用,从而起到免疫增强的作用。