黑肥尾蝎(Androctonus bicolor)主要分布在北非地区,是一种具有重要医学价值的蝎种。研究发现,被黑肥尾蝎(A. bicolor)蜇伤会引起疼痛、局部充血、呕吐、肿胀、躁动和低血压等症状,导致小孩心肌和中枢神经系统功能障碍。小鼠皮下注射实验结果表明,该蝎毒液对小鼠半致死剂量为1.21 mg/kg。表明该种蝎子毒素成分独特,具有重要的研究价值。而目前仅从该蝎基因文库克隆到2个α钠通道毒素。为了更好的了解该蝎毒素多肽多样性,我们结合转录组学和蛋白组学对该蝎毒素多肽进行了系统分析。通过构建高质量的黑肥尾蝎(A. bicolor)毒腺cDNA文库,我们获得了730个毒素多肽序列,对这些新毒素多肽进行序列分析得到103个新多肽,3个多肽与其它蝎种分离到的多肽完全一样。根据这些多肽的序列同源性,这些多肽可分为23个不同的家族：钠通道毒素(NaTx)、短链钾通道毒素(ScKTx)、长链钾通道毒素(LcKTx)、钙通道毒素(CaTx)、 Kunitz类型毒素、抗菌肽、防御肽、缓激肽增效肽(BPP)、阴离子肽(BmKa2类似肽)、6种不含二硫键的新型多肽,以及8种分别含1对、2对、3对、5对和6对二硫键的新型多肽。其中钠通道毒素丰度最高,总共获得了24个新的钠通道毒素,占毒素多肽的33.50%,这些新多肽和已知的钠通道毒素同源性在90%-66%之间。除AbNaTx1, AbNaTx2, AbNaTx3, AbNaTx4和AbNaTx18这5个多肽属于α-钠通道毒素外,剩余19个钠通道毒素均属于β钠通道毒素。这些钠通道毒素中,绝大部分含有4对二硫键,三个多肽含有3对二硫键,分别为AbNaTx20, AbNaTx22和AbNaTx24。a钾通道毒素占整体毒素的24.60%,共鉴定了15个新α钾通道毒素,分属于α-KTx3,α-KTx8, α-KTx14, α-KTx16, α-KTx31和α-KTx32六个亚家族,所有鉴定到的这些新α钾通道毒素均含3对二硫键。p钾通道毒素占毒素比例的7.96%,共发现了10个不同的β钾通道毒素,其中AbKTx-6, AbKTx-9, AbKTx-10和AbKTx-11属于β-KTx Ⅰ家族；AbKTx-2, AbKTx-3, AbKTx-5, AbKTx-7和AbKTx-8属于β-KTx Ⅱ家族；AbKTx-1由86个氨基酸残基组成,含3对二硫键,属于β-KTx I家族。鉴定到1个钙通道毒素AbCaTx1,占毒素的0.32%。鉴定到两个阳离子抗菌肽,命名为Androcin18-3和Androcin18-1,分别含有18和24个氨基酸残基。防御肽占蝎毒多肽的3.50%,共发现了4个新防御肽,分别为AbDef-1, AbDef-3, AbDef-4和AbDef-5,其中AbDef-3和AbDef-4成熟肽长度均为56个氨基酸残基,二者存在8个氨基酸差异,序列同源性为86%。有趣的是AbDef-3和AbDef-4在二硫键数目上有所不同,AbDef-3只有3对二硫键,然而AbDef-4却有4对二硫键。AbDef-3和AbDef-4与现有数据库多肽同源性极低,是一类新的防御肽。我们还发现了两个新的缓激肽增效肽,分别命名为AbBpp-1和AbBpp-2,属于NDBP3家族,编号分别为NDBP3.20和NDBP3.21。鉴定到两个新的NDBP6家族成员：Aba-1和Aba-2二者之间同源性为69%,二者的酸性氨基酸所占比例分别为36%和37%,属于典型的阴离子多肽。Kunitz类型毒素占转录组中毒素多肽的4.80%,共发现了5个该类型多肽,分为两个类别。AbKci-2, AbKci-3, AbKci-4和AbKci-5含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键,二硫键模式为：X3CX24CX20CCX2CX4C; AbKci-1则含有8个半胱氨酸,形成4对二硫键,二硫键模式为：X4CX8CX15CX7CX12CCX2CX4C。共筛选到9个不含二硫键新型多肽,分为6个不同的类型。AbNtl, AbNt2, AbNt3和AbNt4是一类新的蝎不含二硫键多肽,划分为NDBP8家族,分别编号为NDBP8.1, NDBP8.2, NDBP8.3和NDBP8.4,这4个多肽之间具有较高的序列同源性,值得注意的是它们成熟肽是11个氨基酸RFD (A) RAAE (D) AS (G) PG的重复,重复次数分别为9,7,6和6,多肽的C端均为RFDRAS。 AbNt5, AbNt6和AbNt7在氨基酸组成上存在很大差异,分别代表3类富含不同氨基酸残基的不含二硫键多肽,分别编号为NDBP9.1, NDBP10.1和NDBP11.1。 AbNt5富含甘氨酸和酪氨酸,这两种氨基酸分别占氨基酸残基总数的59.2%和14.3%。AbNt6则富含甘氨酸和丙氨酸,’甘氨酸和丙氨酸分别占总氨基酸残基总数的24.6%和29.8%。AbNt7也富含甘氨酸和酪氨酸,酪氨酸残基所占比例高于甘氨酸,两种氨基酸分别占43.2%和21.6%。AbNt8是一个高度亲水的、富含带电荷氨基酸残基的多肽,带负电氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)和带正电氨基酸(赖氨酸,精氨酸和组氨酸)分别占氨基酸残基总数的19.7%和20.9%,编号为NDBP12.1。 AbNt9富含亲水性氨基酸,具有7个由10氨基酸残基YLPTLQKXNR (K)组成的重复。除了发现了不含二硫键新型多肽,我们也筛选到18个新的含不同数目二硫键多肽。发现了7个仅含一对二硫键的新多肽,分为α-TxC2和β-TxC2两种类型。其中α-TxC2包含AbTxC2l, AbTxC22, AbTxC23, AbTxC24和AbTxC25五个多肽,这5个多肽富含碱性氨基酸残基,精氨酸和赖氨酸分别占总氨基酸残基数的39.6%-37.3%不等,具有共同的二硫键模式X2CX34-43CX3-6。 AbTxC210和AbTxC211属于β-TxC2,富含甘氨酸和酪氨酸,甘氨酸和酪氨酸残基占总氨基酸残基的33.4%,具有保守的二硫键模式CX4CX39。AbTxC4l和bTxC42是两个新的富含精氨酸、含有两对二硫键的碱性多肽。AbTxC61和AbTxC62属于一类有3对二硫键的新型多肽,二者之间有一个氨基酸差异。AbTxC63和AbTxC64占毒蝎转录组毒素多肽的0.64%,也含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键,但二硫键模式与AbTxC61和AbTxC62不同。AbAsl, AbAs2和AbAs3是一类与Astakines类似的蝎毒素多肽,含有5对二硫键。AbTxC12l和AbTxC122代表两种不同的含6对二硫键的多肽,二者的二硫键模式分别为X2-5CXCX3-9CX5CX8CXCCX2CX7CX8-9CX5CX13-17CX3-4和X11CX4CX5CX6CX4CX5CX6CX4 CX3CX9CX2CXC。这些新多肽的发现丰富了现有毒素多肽资源,表明了黑肥尾蝎(A.bicolor)毒液多肽具有独特的多样性。我们采用LC-MS/MS方法对黑肥尾蝎(A. bicolor)毒液进行了系统分析。多肽匹配数据库分别为：1) UniProt蛋白数据库与蝎有关序列；2)马氏正钳蝎(M. martensii)基因组所预测的32016条蛋白序列；3)墨西哥雕像木蝎(C. exilicauda)基因组预测的30465条蛋白序列和4)黑肥尾蝎(A. bicolor)转录组测序获得的208条多肽和蛋白序列。从四个不同的数据库中共鉴定到155条可与谱图匹配的不同肽段,与上述4个数据库匹配的肽段数目分别为24,56,18和57。对不同数据库匹配肽段比较,删除冗余匹配肽段,共获得141条唯一肽段。这些匹配的肽段中,绝大部分编码保守细胞组分或蛋白。共从毒液鉴定了16个毒素多肽,包含1个钙通道毒素(AbCaTxl),1个Kunitz类型毒素(AbKci-5),3个钾通道毒素(AbKTx-2, AbKTx-6和 AbTx4),10个钠通道毒素(AbNaTx7, AbNaTx17, AbNaTx12, AbNaTx15, AbNaTx18, AbNaTx2, AbNaTx25, AbNaTx3, AbNaTx6和Ab8)和一个含3对二硫键的新多肽AbTxC61。其中鉴定到的钠通道毒素数目最多,序列覆盖率也相对较高(覆盖率范围18.7%-90.7%),表明了钠通道毒素是黑肥尾蝎(A. bicolor)毒液丰度最高的毒素类型。值得注意得是,AbTxC6l单个毒素占毒液相对丰度34.39%,表明了该多肽具有重要的生物学功能。这些结果表明黑肥尾蝎(A. bicolor)与旧大陆蝎种马氏正钳蝎(M. martensii)的亲缘关系近于与新大陆蝎种墨西哥雕像木蝎(C. exilicauda)的亲缘关系。不同生理状态蝎毒组分存在差异,不同蝎种的细胞蛋白存在一定的保守性,而不同蝎种在毒素组成上却存在较大的特异性。蝎毒素多肽是蝎进行捕食和防御的重要武器,每种蝎中含有大量的具有不同生物活性的蝎毒素多肽。蝎毒素多肽在结构和功能上具有丰富的多样性,而产生这种多样性的具体机制不明。钾离子通道是现今发现的离子通道中最具多样性的离子通道。研究表明,蝎钾通道毒素能特异性靶向结合不同钾通道,因此是研究钾离子通道结构和功能很好的探针。然而,目前从蝎毒液中分离到的钾通道毒素为数不多,并且蝎毒腺中毒素多肽库的形成机制还知之甚少。在第四章研究中,通过筛选,从东亚钳蝎(M. martensii Karsch)毒腺cDNA文库中发现了三个新的α钾离子通道多肽,分别命名为BmKcugl, BmKcug2和BmKcugx。其中,BmKcugl和BmKcug2属于a-KTxl家族,按照蝎α钾通道毒素分类原则将其分别编号为a-KTxl.14和a-KTxl.15。 BmKcugx则和已发现的蝎钾通道毒素各家族多肽的同源性均低于29%,表明其代表一个新的蝎钾通道毒素类别,a-KTx22,并将其编号为a-KTx22.1。通过PCR扩增,我们获得了一个新多肽基因BmKcuglam序列比对发现BmKcugl和BmKcugla存在6个氨基酸残基差异,表明二者基因通过基因复制产生。对BmKcugla, BmKcug2和BmKcugx基因结构分析发现,BmKcugx基因由两个外显子和一个插入在信号肽编码区的内含子组成,而BmKcugla和BmKcug2基因则由3个外显子和两个内含子构成,这两个内含子分别位于5’UTR和信号肽编码区。对BmKcugla和BmKcug2基因进行序列比对发现,二者基因序列存在80.5%的同源性。BmKcugla和BmKcug2位于信号肽区域的内含子具有相同的5’和3’剪切位点,且二者5’UTR内含子5’剪切位点也一样,仅在3’剪切位点存在差异,我们推测BmKcug2转录本的5’UTR内含子1和外显子2连接处发生了可变剪切现象。对BmKcugla, BmKcug2和BmKcugx转录本丰度比较分析,发现BmKcugla和BmKcug2的转录本比BmKcugx转录本高很多,暗示5’UTR的内含子能显著提高钾离子通道毒素的表达水平。通过前章研究,我们发现蝎α钾通道毒素基因存在内含子数目多态性,且发现5’UTR内含子位于编码框上游25-35 bp位置。在前章研究基础上,我们选择5’UTR长的钾通道毒素,并根据其cDNA设计引物进行基因扩增。对获得的13个不同的钾通道毒素基因进行内含子分析,发现大部分钾通道毒素5’UTR区域含有内含子,如BmTxl, BmKcug2, BmTx4, BmTx3B, BmTx2, BmKcugla, BmP08, sKTx2和 BmTxKS3这9个基因含有两个保守的内含子,而BmK38, BmK39, BmKcugx和abTxl则只包含一个保守的内含子。并对这些多肽的二级结构、二硫键连接模式以及内含子剪切位点进行了分析。系统进化分析结果显示,BmK38, BmK39, BmKcugx和abTxl位于进化树的根部位置,表明这4个多肽相对于其它多肽在进化上较为古老,由于蝎毒素基因是通过共同的祖先通过基因复制以及随后的突变进化产生,因此我们推测BmTxl, BmKcug2, BmTx4, BmTx3B, BmTx2, BmKcugla, BmP08, sKTx2和BmTxKS3在进化过程中,它们的5’UTR区域获得了一个内含子。比较这些多肽转录本相对丰度,发现含两个内含子的多肽丰度普遍高于含一个内含子多肽的丰度,表明新获得的5’UTR内含子能显著增强基因的表达水平,增加了蝎在捕猎和防御过程中单次喷射毒液中这些钾通道毒素的含量,因此我们推测这是蝎子适应环境选择压力的一种策略。综上所述,本研究结合转录组和蛋白组方法,对黑肥尾蝎(A. bicolor)毒液多态性进行了系统研究,共获得了103个新的毒素多肽基因,其中16个多肽进行了蛋白水平鉴定。这是首次对Androctonus属蝎进行转录组分析,揭示了黑肥尾蝎(A. bicolor)蝎毒液多肽独特多样性。这些结果丰富了现有蝎毒素多肽资源库,为Androctonus属蝎蛰伤引起的中毒症状提供了科学解释和依据。对蝎短链钾通道毒素基因结构分析发现了蝎短链a钾通道毒素内含子数目存在多肽性,并且发现了蝎短链a钾通道毒素存在可变剪切和内含子获得现象,为研究蝎毒素进化规律提供了材料。