尽管人类外周血γδT细胞在整个T细胞群体中所占比例较少,但其在机体对抗感染和肿瘤的免疫应答中的重要作用却深受关注。然而,至今为止,γδT细胞所识别的抗原则很少被鉴定。不了解T细胞受体(TCR)γδ所识别配体,也就不可能深入了解γδT细胞的生物学功能。因此,进一步发现和鉴定TCRγδ所识别配体则成为γδT细胞研究领域亟待解决的突出问题。如何通过新的技术策略,来发现TCRγδ所识别新型配体是本研究着重考虑的科学问题,这也是进一步了解TCRγδ抗原识别特异性和多样性机制,揭示γδT细胞的生物学功能的关键问题。TCR的抗原结合部位是由六个抗原决定簇(CDR)形成的,这六个CDR在识别抗原时作用是不相同的,其CDR3区在抗原识别时占有主导地位。鉴于TCRδCDR3区(CDR3δ)与抗体重链的CDR3区在结构和功能上的相似性,因此,我们提出了CDR3δ的一级结构是决定TCRγδ识别抗原特异性的关键部位的学术假说。这一假说已为我们实验室前期工作所验证。我们根据卵巢上皮癌(OEC)组织浸润的γδT细胞(γδTIL)TCR的一个CDR3δ的基因序列(OT3),人工合成了OT3肽,并通过体外一系列OT3肽与靶细胞、靶组织或来源于靶细胞的蛋白的体外结合实验,验证OT3肽的结合特异性,所采用的方法包括OT3肽介导的生物传感器,免疫荧光技术,酶免疫技术和OT3肽竞争结合实验。同时,构建了用OT3序列替代抗体重链CDR3区序列的OT3移植抗体OT3Ab,也进行相应实验。本研究又重复了部分上述验证工作。结果显示,OT3肽和OT3Ab在对靶细胞、靶组织或来源靶细胞的蛋白的结合活性上享有相似的特异性。这就证明了CDR3δ确实在TCRγδ抗原识别特异性上起关键作用,也提示OT3肽能作为一个特异的探针,去筛选TCRγδ识别的抗原。在上述验证工作的基础上,本研究共采用了三种技术策略去寻找TCRγδ识别的蛋白抗原:一是以OT3肽为探针在噬菌体随机展示十二肽库中筛选与OT3肽结合的十二肽,通过序列比对获得相应蛋白;二是以OT3肽为探针在人卵巢癌cDNAλ噬菌体表达文库筛选与OT3肽结合的克隆,通过测序鉴定蛋白;三是通过OT3肽偶联的亲和层析,从OEC肿瘤细胞系(SKOV3细胞)的总蛋白中分离与OT3肽特异性结合的蛋白,再利用质谱技术鉴定蛋白的种类。应用第一种技术策略,我们获得了三个OT3肽特异结合的十二肽。结合和功能验证实验结果显示,这些十二肽不但能特异性地结合TCRγδ,还能在体外促进γδT细胞活化,提示这些十二肽具有TCRγδ的表位肽活性。然而,在BLAST比对中未发现与这些多肽在序列上相匹配的人类相关蛋白,提示这些十二肽可能为来源于其它种属的表位肽。筛选人卵巢癌cDNAλ噬菌体表达文库要求探针具有较高的特异性和亲和力,在这两方面OT3肽不如一般的抗体,因此第二种策略也失败了。通过第三种策略,我们成功鉴定了三个TCRγδ识别的肿瘤相关抗原,它们是丙酮酸激酶3,人mutS同源蛋白2(hMSH2)和热休克蛋白(HSP)60。由于已有报道HSP60能被TCRγδ所识别,故鉴定出HSP60表明我们的策略是可行的。而丙酮酸激酶3以及与DNA损伤修复有关的hMSH2可能是TCRγδ识别的新的蛋白抗原。本研究就hMSH2是否为TCRγδ配体这一问题进行了验证。RT-PCR结果显示,在卵巢癌细胞系SKOV3中,hMSH2 cDNA存在散在分布的点突变。SKOV3细胞培养上清中检测到分泌形式的hMSH2。用Western blotting在SKOV3细胞总蛋白中还发现一个60kD的hMSH2的缺失突变表达形式。而且,在包括SKOV3细胞在内的很多肿瘤细胞系细胞膜上均检测到hMSH2的表达。免疫组化结果证明,肿瘤组织中也有异位表达的hMSH2。另外,Vδ2γδT细胞对SKOV3细胞的细胞毒活性也能被抗hMSH2抗体部分封闭。同时,本研究还构建和表达了五种重组的hMSH2蛋白,包括hMSH2全长蛋白,分别含hMSH2 N端两个结构域和C端两个结构域的蛋白片段,以及SKOV3细胞表达的含有散在突变的两个分段蛋白。所有的这五个蛋白都能特异性与Vδ2γδT细胞结合,并刺激其活化增殖,分泌γ干扰素,并且促进Vδ2γδT细胞对靶细胞的杀伤活性。此外,本研究还利用昆虫病毒表达系统,得到了比原核大肠杆菌表达系统更具生物活性的hMSH2蛋白,这为hMSH2蛋白进一步结构与功能研究奠定了基础。综上所述,本研究取得了以下学术成果:1、证明了CDR3δ在决定TCRγδ识别抗原特异性上的关键作用,TCRγδ识别抗原时仅仅依赖CDR3δ一级结构的特异性,因此人工合成的CDR3δ肽OT3是寻找TCRγδ抗原的很奏效的探针;2、建立了一个采用基于CDR3δ肽结合特性的免疫-生物化学技术策略鉴定TCRγδ所识别的蛋白抗原的新的有效的方法;3、首次发现在癌变的情况下,异位表达的hMSH2很可能是一个新的Vδ2γδT细胞所识别的肿瘤配体分子,其生物学意义在于对固有免疫系统的预警作用;4、证明了昆虫病毒表达系统是一个稳定而有效的真核表达系统,在昆虫细胞中能完成很多翻译后的修饰,在使表达的外源蛋白保有天然蛋白的生物学活性上至关重要。在上述的四点成果中,第二项和第三项最具有创新性。第二项成果解决了一项长期困扰免疫学界的难题,为鉴定TCRγδ所识别新型配体提供了一个有效的关键技术。第三项成果揭示了γδT细胞免疫监视的新型作用方式,为全面阐明γδT细胞生物学功能提供了重要的线索,也为肿瘤的诊治提供了一个重要的靶标分子。