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背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率在我国高居恶性肿瘤的第四位,死亡率更是高居第三位。我国每年新发肝癌46.6万,每年因肝癌死亡42.2万,两者均占全世界总数的50%以上。肝细胞癌具有起病隐匿、早期诊断困难、肝切除术后容易复发转移和晚期治愈率低等特点,对我国乃至全球人民的健康造成极其严重的危害。因此,早期肿瘤标志物的寻找、个体化精准诊断和治疗的实施、预后复发转移预警标记物的确立是目前肝癌诊治中亟需解决的问题。目的1.比较HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌与相应癌旁组织中的表达差异,分析HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝癌患者临床病理特征及预后之间的相关性,从而验证HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌中作为新型分子标志物的潜在价值。2.明确JNJ-26481585对肝癌细胞体外增殖和体内成瘤的抑制作用,并利用细胞和分子生物学技术探讨JNJ-26481585抑制肝癌细胞增殖的机制,进一步探究JNJ-26481585促进肝癌细胞G0/G1期阻滞及诱导肝癌细胞凋亡的具体机制。3.明确JNJ-26481585与Sorafenib联合应用可以呈协同方式,抑制肝癌细胞体外增殖和体内成瘤,进一步探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用在体内外协同抑制肝癌细胞增殖的分子机制。4.探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。方法1.使用蛋白免疫印迹、免疫组织化学实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达水平,评价HDAC1、HDAC2、HDAC4在这两种组织中的表达差异。根据免疫组织化学评分结果,分析111例肝细胞癌组织中IHEDAC1、HDAC2、HDAC4的表达水平与临床病理特征及预后之间的相关性。2.使用实时荧光定量PCR实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞QSG-7701中mRNA的表达水平。3.通过CCK-8细胞活力检测、平板克隆形成、EDU实验,评估JNJ-26481585对肝癌细胞增殖的抑制作用。利用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,探究JNJ-26481585对肝癌细胞周期、凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的作用。4.利用流式细胞术检测AKT抑制剂MK2206 2HCL对JNJ-26481585诱导细胞周期的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞周期阻滞的分子机制。5.利用流式细胞术检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。6.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。7.利用CompuSyn软件计算JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后的联合指数(Combination Index,CI),明确 JNJ-26481585 与 Sorafenib 联合应用呈协同方式,并且确定两药联合应用的最佳搭配浓度。8.利用流式细胞术检测细胞凋亡,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对肝癌细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞凋亡相关蛋白的作用。9.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。10.在裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型中,评估JNJ-26481585在体内抑制肝癌细胞生长以及与Sorafenib联用后抑制肝癌细胞增殖的作用。11.利用HE染色法检测裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型体内重要脏器的组织形态学变化,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。12.利用免疫组化检测裸鼠瘤体组织的磷酸化JNK、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Ki67的蛋白表达情况;通过Tunel染色检测瘤体肿瘤细胞的凋亡情况;从而在体内探索JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。结果1.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平在肝癌组织中要高于相应癌旁组织。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,即HDAC1在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,门静脉血管就越容易被肿瘤侵犯,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度;HDAC2在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,组织学分化程度就越差;HDAC4在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度。3.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者术后总体生存率存在着密切关系,即低表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显长于高表达患者。4.HDAC1、HDAC2、]HEDAC4在肝癌细胞系中的mRNA表达水平要高于正常肝细胞。5.JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而诱导肝癌细胞周期阻滞。6.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP、Bax 的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Survivin的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。7.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外均能够协同抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。8.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。9.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。结论1.HDAC1、HDAC2、HDAC4 在肝癌组织显著高表达,HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,高表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显短于低表达患者。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4对患者预后具有预警价值,未来有希望作为肝细胞癌术后新型预警分子标记物。3.JNJ-26481585通过调控PIBK/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而促进肝癌细胞的周期阻滞。4.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白的表达水平,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。5.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内体外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。6.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。