【摘 要】
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白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）属于线头病毒科（Nimaviridae）,白斑病毒属（Whispovirus）,是一种棒状或椭圆状双链DNA病毒,基因组大小约300kbp。WSSV的宿主广泛,对甲壳动物尤其是对虾类有很高的感染力和致死率。WSSV的迅速传播和高死亡率长期困扰着世界虾类养殖业,并造成了巨大的经济损失,但目前仍未发现有效的途径和方法用于预防
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白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）属于线头病毒科（Nimaviridae）,白斑病毒属（Whispovirus）,是一种棒状或椭圆状双链DNA病毒,基因组大小约300kbp。WSSV的宿主广泛,对甲壳动物尤其是对虾类有很高的感染力和致死率。WSSV的迅速传播和高死亡率长期困扰着世界虾类养殖业,并造成了巨大的经济损失,但目前仍未发现有效的途径和方法用于预防和治疗WSSV的感染。因此,对于WSSV感染机制的进一步研究将有助于寻找预防和治疗WSSV感染的有效方法。众所周知,细胞骨架在病毒的入侵、转运和释放等过程中起着重要作用,并通过响应不同的生理状态或通过动态的连续聚合、解聚和重排过程参与病毒感染过程。作为细胞骨架的重要调节因子,Flightless-Ⅰ是肌动蛋白相关蛋白gelsolin家族的一员,参与促进肌动蛋白骨架的解聚和重排,从而调节多种生物过程,包括细胞增殖、分化、凋亡和免疫应答。而关于Flightless-Ⅰ在甲壳类动物中对病毒感染的调控,目前还知之甚少。而在本实验前期的差异转录组文库发现,红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）造血组织（hematopoietic tissue,Hpt）细胞中CqFlightless-Ⅰ的表达在WSSV感染1小时后被上调,提示CqFlightless-Ⅰ可能参与WSSV的早期感染过程。为了进一步研究CqFlightless-Ⅰ参与WSSV感染宿主的分子机制,本论文以红螯螯虾的Hpt为细胞模型开展研究,获得以下结果:1.从红螯螯虾转录组文库中筛选并克隆获得CqFlightless-Ⅰ开放阅读框（Openreadingframe,ORF）的cDNA序列,最终鉴定该基因ORF大小为3870 bp,编码1290个氨基酸,包括11个富含亮氨酸重复（leucine-richrepeat,LRR）结构域和6个凝胶蛋白（gelsolin-like,GEL）结构域。多序列比对及系统发育树分析表明,Flightless-Ⅰ的氨基酸序列从哺乳动物（如人、小鼠）到节肢动物（如凡纳滨对虾）的相似性都较高,其中CqFlightless-Ⅰ与凡纳滨对虾的Flightless-Ⅰ同源性最高。实时荧光定量PCR对红螯螯虾十二种组织中CqFlightless-Ⅰ的表达情况分析表明,CqFlightless-Ⅰ在所检测的十二种组织中均有表达,其中在肌肉中的表达量最高,其次是造血组织,而在眼柄和胃中表达量都比较低。2.WSSV感染Hpt细胞1、3、6、12、24小时后,CqFlightless-Ⅰ的表达被显著上调。此外,在Hpt细胞中敲降CqFlightless-Ⅰ基因,病毒早期基因IE1和囊膜蛋白基因VP28在WSSV感染后3、6、12小时均显著增加;同样,在敲降CqFlightless-Ⅰ基因的Hpt细胞中,WSSV的主要囊膜蛋白VP28在WSSV感染1小时后显著增多,这表明CqFlightless-Ⅰ在WSSV的感染过程中可能发挥了重要作用,从而导致WSSV的感染效率降低。3.Pulldown和免疫共沉淀（Co-IP）实验的结果表明:CqFlightless-Ⅰ的GEL结构域蛋白与Hpt细胞骨架蛋白Cqβ-actin相互作用,且过表达CqFlightless-Ⅰ的GEL结构域导致HeLa细胞的细胞骨架发生明显的解聚,提示CqFlightless-Ⅰ可能通过解聚细胞骨架导致WSSV在细胞中的运输效率降低。4.在Hpt细胞中敲降CqFlightless-Ⅰ后,内体相关蛋白CqVCP、CqRabGEF1的表达量明显增多,而自噬相关蛋白CqGABARAP的表达量则无明显变化,提示CqFlightless-Ⅰ很可能还降低了 WSSV的内体运输效率,而对自噬参与的WSSV感染途径则可能没有影响。综上,本研究阐明了 CqFlightless-Ⅰ通过解聚细胞骨架降低了 WSSV的感染效率,同时降低了 WSSV的内体运输,为进一步寻找预防和控制WSSV感染提供了新的理论参考。
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