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中枢神经系统（central nervous system,CNS）髓鞘损伤是脱髓鞘疾病的主要病理特点,少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells,OPCs）分化是髓鞘修复的治疗靶点。通过前期的研究发现,在髓鞘损伤的病变区有大量的血小板生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptorα,PDGFRα）阳性的OPCs聚集,并且分化受阻。然而,目前临床上使用的药物对OPCs分化和髓鞘修复的治疗作用有限,主要原因是药物在病灶区域难以达到有效浓度。因此,将药物高效递送到CNS病变区域对于MS的治疗具有重要意义。细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）有着良好的生物相容性,易于穿透血脑屏障,并且可通过表面配体修饰增强其靶向性,这使得EVs具有潜在发展为临床应用级别的药物载体。基于上述研究背景,本课题首先通过RNA-Seq及免疫荧光染色等方法明确了OPCs在脱髓鞘微环境下的分布及表达模式;随后筛选获得靶向配体并利用XStamp技术制备了具有趋向能力的EVPs;在治疗应用之前,将该新型EVPs通过体外、体内及在体三个层面评估了其良好的靶向性;最后将EVPs负载促髓鞘再生药物三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine,T3）用于治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）和铜腙动物模型（cuprizone,CPZ）,检测其向中枢靶向递送药物后在脱髓鞘疾病模型中治疗效果。这项研究的开展将有望为CNS药物的靶向递送提供潜在的高效治疗方式。主要的研究内容及结果如下:1.明确T3对OPCs的作用效果首先,分离新生鼠的OPCs,通过CCK8评估T3对原代OPCs细胞活力的影响,明确T3的安全使用剂量范围。其次,加入不同浓度的T3,3天后评估细胞的分化状态。随后对细胞进行固定和免疫荧光染色,评估CNPase+OPC数目的百分比,确定最佳的促进分化剂量。最后结合免疫荧光染色和CCK8的结果,明确T3促进OPCs分化的安全剂量。2.构建可靶向中枢脱髓鞘病变部位的EVs通过对多发性硬化（Multiple sclerosis MS）病人、EAE小鼠、CPZ诱导的脱髓鞘模型小鼠病灶区域的免疫荧光染色,发现大量的Olig2+PDGFRα+OPCs聚集在病灶区域,明确了OPCs可作为药物递送的靶细胞。同时通过RNA-seq检测EAE小鼠模型中OPCs的基因表达模式,进一步确定了靶向递药系统的结合受体,即PDGFRα。然后克隆PDGFRα的配体PDGFA,并构建包装慢病毒载体LV-XStamp-PDGFA感染神经干细胞,通过药物筛选获得稳定表达的神经干细胞株,该细胞株分泌的EVs膜表面将富集配体PDGFA,因此将这种EVs命名为EVPs。使用透射电镜、纳米颗粒粒径分布、标志蛋白检测和Nanoview对EVs与EVPs进行表征,两者未见显著差异,表明EVPs构建成功。随后通过超声法将T3装载于EVPs中,检测EVPs的装载效率为51.9%,证明EVPs载药的可行性。3.明确EVPs对中枢神经系统的靶向性从三个不同的层面分析EVPs对CNS病灶部位的靶向性。首先,培养原代OPCs、神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞,分别与标记有红色荧光探针的EVs/EVPs孵育、固定并进行免疫荧光染色,结果显示EVPs具有更强的与PDGFR+OPCs结合的能力。随后,发现无论在正常条件还是炎症条件下,EVPs均可靶向PDGFRα+OPCs。其次,为了探究在体内EVPs对CNS中神经细胞的靶向性,将标记后的EVs/EVPs通过尾静脉的方式注射到EAE小鼠和CPZ小鼠体内,3天后分离小鼠的脑和脊髓进行切片染色。研究结果表明EVPs在增强对OPCs和OLGs靶向性的同时,还降低了神经元的摄取率。最后检测EVs/EVPs在EAE小鼠不同器官中的分布水平,将Di R染料标记的EVs/EVPs注射到小鼠体内,24小时后取出各器官检测EVs/EVPs在EAE脊髓病灶区域的趋向性。以上实验反映出EVPs对脱髓鞘动物模型病灶部位的PDGFRα+OPCs具有良好的靶向性。4.评估EVPs装载T3对脱髓鞘动物模型的治疗效果于EAE发病高峰期通过尾静脉每三天分别注射EVPs+T3、EVPs以及T3。通过临床评分判断EVPs+T3是否能够有效缓解小鼠的临床症状。根据免疫组化染色的结果发现EVPs+T3能够降低炎性细胞的浸润和髓鞘脱失,免疫荧光染色结果进一步印证EVPs+T3降低了MBP+髓鞘脱失,促进了OPCs向OLGs的分化,并且通过电镜分析髓鞘的g-ratio证明EVPs+T3恢复了病灶处的髓鞘再生。在CPZ小鼠模型中也观察到了相似的现象,即通过LFB和MBP染色证实了EVPs+T3降低了髓鞘损伤水平的同时促进了OPCs分化和髓鞘再生;此外,EVPs+T3还有效降低了胶质细胞增殖和轴突损伤,改变了小胶质细胞由促炎型向神经保护型的表型转换。综上所述,本课题构建了一种由神经干细胞产生的可靶向CNS病灶部位的细胞外囊泡的药物载体,使用多种手段检测了该药物载体在保持原有生物学表征的基础上,能够实现对病灶处靶细胞的高效结合能力,进而在EAE和CPZ等脱髓鞘动物模型上证实了该新型药物递送系统的治疗效果。因此,该研究的完成将有助于为脱髓鞘疾病提供有效的治疗手段,并为其应用于不同的CNS疾病的临床治疗奠定理论基础。