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前言下咽鳞状细胞癌是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤之一,具有发生位置隐蔽、浸润性极强、易粘膜下扩散、原发病变呈多中心生长的特点。因早期无明显的症状、缺乏特异性体征和可靠的诊断措施,所以,多数患者在临床确诊并接受治疗时,已属于晚期,病变常累及喉腔、颈段食道和舌根等器官；同时,由于喉咽部淋巴管丰富,极易发生颈淋巴结转移和包膜外扩散,并侵犯周围组织器官,如颈动脉等重要的血管,所以,下咽鳞癌是头颈部预后最差的恶性肿瘤之一。由于下咽癌生长部位的特殊性,手术治疗后,可能导致语言、呼吸及吞咽器官的功能障碍,严重影响患者的生存质量；而放疗和化疗又存在治疗不彻底、并发症多、患者痛苦较大等问题。因此,尽快在分子生物学的基础上提出新的诊断方法和简便有效、毒副作用小的治疗手段就成为亟须解决的课题。生物膜是细胞生命活动的主要结构基础,与细胞的恶性转化及肿瘤的演进密切相关。上个世纪50年代,Yamada用电子显微镜发现并命名了细胞质膜微囊—Caveolae;1972年,Singer和Nicolson提出“液相双层脂质镶嵌模型”；20世纪90年代研究发现：细胞膜的双层脂质结构是不均一的,结构蛋白Caveolin与某些富含胆固醇和鞘脂的微区域的结构变化密切相关,这些区域被称为脂筏,无结构蛋白时呈平板状,脂筏与Caveolin结合后形成的烧瓶状膜结构即Caveolae。Caveolin-1(CAV1)是Caveolae的标志性蛋白,为分子量约22kd的膜内蛋白质,其基因位于7q31.1,是形成烧瓶状结构Caveolae的必需成分。目前,CAV1与肿瘤形成之间的关系已成为研究的热点。研究证实：在大多数肿瘤细胞中,如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肉瘤,CAV1表达下降,为抑癌基因；但在某些肿瘤,如甲状腺滤泡状癌中没有CAV1的表达；而在前列腺癌、胰腺导管腺癌及食道鳞状细胞癌中其表达水平上调,提示：在这些癌的形成过程中,CAV1是作为肿瘤促进因子。因此,CAV1在肿瘤中的作用可能与组织相关。在本课题中,我们成功构建了CAV1-小干扰RNA-慢病毒载体,通过感染下咽癌FaDu细胞株,进而检测CAV1对该细胞株体外生长的作用；并成功构建下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤动物模型,通过定期瘤体注射CAV1-小干扰RNA-慢病毒载体,以及后期对肿瘤组织的检测来研究CAVl对FaDu细胞株体内生长的作用。目的构建人CAV1-小干扰RNA-慢病毒载体(CAV1-RNAi-lentivirus)并转染下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株,筛选获得稳定干扰CAV1表达的FaDu细胞。进而探讨CAV1-RNAi-lentivirus对人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株体内和体外生长的影响。方法1.构建人CAV1-RNA干扰慢病毒载体。设计针对CAVl的shRNA序列,Age Ⅰ和EcoRⅠ进行载体质粒双酶切,应用基因重组技术插入pGCSL-GFP慢病毒表达载体中,RT-PCR和DNA测序鉴定重组克隆。重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine TM2000共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并进行大量包装和备用细胞转染。2. CAV1-RNAi-lentivirus对FaDu细胞体外生长的作用。应用CAV1-RNAi-lentivirus转染FaDu细胞,实验设立pGCSL-GFP-空载体对照组(GFP-lentivirus)和空白对照组。确定G418的最佳筛选浓度,于转染24h后,加入最佳筛选浓度的G418筛选稳定干扰CAV1表达的细胞。待细胞生长成肉眼可见的克隆后,使用浸有胰酶的无菌滤纸片消化挑取克隆,扩增培养。荧光倒置显微镜下观察并计算CAV1-RNAi-lentivirus的转染效率。采用RT-PCR、Western-blot方法检测细胞中CAV1的mRNA和蛋白水平的敲除效率。应用原位末端标记法(TdT-mediated dUTPnick end labeling, TUNEL)检测转染CAV1-RNAi-lentivirus后FaDu细胞的体外凋亡情况。3. CAV1-RNAi-lentivirus对FaDu细胞体内生长的作用。构建BALB/c-nude裸鼠下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤模型,待肿瘤长至一定时间和体积时,将所有动物随机分组。实验设立GFP-lentivirus阴性对照组和空白对照组。给药方法采用瘤周多点注射。实验组动物每周定期瘤周注射CAV1-RNAi-lentivirus(1×107TU,0.1m1),阴性对照组动物注射GFP-lentivirus(1×107TU,0.1ml),空白对照组注射同剂量的PBS,并每隔4d测量各组所有动物的肿瘤最长径与最短径,计算肿瘤体积变化和抑制率。自注射时间起32d后,采用脱臼法处死实验动物并取出移植瘤,测量标本体积并称重。以RT-PCR.免疫组化等方法检测三组肿瘤组织中目的基因CAV1的mRNA和蛋白表达变化情况,从而对CAV1-小干扰RNA-慢病毒载体在FaDu细胞株体内生长的作用进行评价,并探讨其可能的作用机制。结果1.RT-PCR和DNA测序鉴定重组克隆结果显示,实验采用基因重组技术成功构建CAV1-小干扰RNA-慢病毒载体,命名为CAV1-RNAi-lentivirus,测定滴度为1×108U/ml。2.将CAVl-小干扰RNA-慢病毒载体转染下咽癌FaDu细胞,经G418筛选,30天后获得稳定干扰CAV1表达的细胞,细胞转染效率>90%。运用RT-PCR检测方法证实,与空白对照组(1.297±0.068)和阴性对照组(1.183±0.093)相比,RNA干扰组细胞的CAV1的mRNA表达明显降低(0.47±0.050,P<0.05),差异有统计学意义。Western-blot检测结果表明,与空白对照组(0.973±0.117)和阴性对照组(0.83±0.091)相比,CAV1-RNAi-Lentivirus转染组细胞的CAV1蛋白表达水平(0.43±0.098,P<0.05)明显降低,差异有统计学意义。TUNEL检测结果证实,与空白对照组(AI=5.55±0.47%)和阴性对照组(AI=7.52±1.90%)相比,CAV1-RNAi-Lentivirus转染组(AI=22.39±2.61%,P<0.05)细胞的凋亡指数明显增加,差异有统计学意义。3.成功构建BALB/c-nude裸鼠下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤模型。定期注射CAV1-RNAi-Lentivirus组的裸鼠移植瘤平均重量和体积(1.24±0.42g,1.40±0.49cm3),均低于阴性对照组裸鼠移植瘤(1.79±0.42g,1.97±0.45cm3)和空白对照组移植瘤(1.88±0.54g,2.10±0.55cm3,P<0.05)。抑瘤率分别为30.8%和34.0%。对各组移植瘤进行的RT-PCR检测结果证实,与空白对照组(1.348±0.031)和阴性对照组(1.175±0.055)相比,CAV1-RNAi-Lentivirus注射组肿瘤组织的CAV1mRNA(0.671±0.070,P<0.05)表达水平降低,条带亮度明显减弱,差异有统计学意义。免疫组化染色结果显示,虽然治疗组移植瘤CAVl蛋白表达下降,但差异没有统计学意义(P>0.05)。结论本研究结果表明,重组CAV1-RNAi-lentivirus在体外转染下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株后,G418筛选30天后可以获得稳定干扰CAV1表达的细胞,RT-PCR和Western-blot检测方法验证了基因的敲除效率。TUNEL实验结果显示,体外培养过程中,下调CAV1基因的表达,FaDu细胞的凋亡比对照组明显增加。实验成功构建BALB/c-nude裸鼠下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤模型,待肿瘤长至一定体积后,应用CAV1-RNAi-lentivirus定期瘤内多点注射,可以减缓肿瘤组织的生长,即FaDu细胞在体内的生长增殖受到抑制。以上实验结果提示,CAV1在下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株的生长过程中可能起肿瘤促进因子的作用,下调CAV1的表达可能成为FaDu细胞形成的下咽癌的治疗方法之一。