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矮化密植是我国以及当今世界梨树栽培的发展趋势。选择一种合适的矮化砧木成为实现梨矮化密植栽培模式的重要因素之一。杜梨(Pyrus betulifotia)是我国北方梨产区应用最为广泛的梨砧木，具有适应性强、抗逆性强、与东西方梨嫁接亲和力均强等优良特性，但是其并不具备矮化效果。因此，选育具有矮化效果的杜梨砧木成为我国梨栽培发展中亟待解决的问题。随着基因编辑技术的发展，定向改良砧木的某一性状已成为可能。蛋白脂酰转移酶（protein S-acyltransferase，简称PAT）10（又称蛋白质棕榈酰化转移酶）是一种蛋白质的翻译后修饰酰基化的类型，对植物的生长发育起到重要的作用。前人研究表明，PAT10基因功能的缺失会导致植株表现矮生性状。
本试验以杜梨(Pyrus betulifolia)和‘新梨7号’为试材。初步建立了‘新梨7号’叶片离体再生体系，进而构建了‘新梨7号’叶片的遗传转化体系。对杜梨、‘新梨7号’PbPAT10基因进行克隆、测序，并在酵母和拟南芥中对杜梨PbPAT10基因进行了功能验证;同时，分别构建了杜梨和‘新梨7号’PbPAT10基因相应的CRISPR/Cas9表达载体，并获得了杜梨和‘新梨7号’抗性植株，旨在明确梨PbPAT10基因功能并为下一步获得具有矮生性状的梨突变体植株，为梨矮化密植的遗传改良研究提供新途径。其主要研究结果如下:
1.验证了杜梨PbPAT10基因与拟南芥该基因具有相同功能——矮生的功能
构建了杜梨PbPAT10基因的过表达的载体，并在拟南芥AtPAT10杂合突变体（T-DNA插入）中恢复试验。结果表明，转化杜梨PbPAT10的拟南芥株高与纯和突变体相比明显增高，接近拟南芥WT Col-0型的株高。在杜梨PbPAT10酶活性区域的第194的半胱氨酸进行了点突变。通过酵母互补试验发现梨点突变PbPAT10基因不能恢复酵母的活性，而正常的杜梨PbPAT10可以恢复酵母的活性，明确了杜梨PbPAT10基因与拟南芥PbPAT10基因功能类似。
2.初步建立了‘新梨7号’的遗传转化体系
初步建立了‘新梨7号’离体再生体系。通过调整6-BA、IBA、TDZ、NAA四种植物生长调节剂的浓度和配比，筛选出了适合‘新梨7号’再生的植物培养基配方:NN6922.2g/L+6-BA1.0mg/L+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L。
构建了‘新梨7号’的遗传转化体系。在转化体系中，将。新梨7号’叶片依次进行共培养、筛选培养。其培养基成分与时间依次为:共培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA1.0mg/L+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L，暗培养2-3天;筛选培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA1.0mg/L+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L+Kan20mg/L+Cef400mg/L，暗培养至出苗为止。
3.构建了梨PbPAT10基因CRISPR/Cas9表达载体，并获得梨抗性植株
成功构建r杜梨和‘新梨7号’的PbPAT10-2的CRISPR/Cas9表达载体。试验设计了两个靶点，用Overlapping PCR的方法分别构建了杜梨PbPAT10-2和‘新梨7号’PbPAT10-2基因的sgRNA表达盒，再将sgRNA表达盒和pCRISPR/Cas9P35S-N质粒经限制性内切酶BasⅠ和T4连接酶的共同作用下，得到2个以卡那霉素筛选为标记基因的PbPAT10-2的CRISPR/Cas9表达载体。利用杜梨子叶再生和‘新梨7号’叶片再生，经过农杆菌侵染，获到了5棵杜梨的抗性苗和4棵‘新梨7号’的抗性苗。
4.杜梨原生质体制备，确定了最适的酶解时间为12h，并且纤维素酶和果胶酶组合一起使用的效果要比离析酶和纤维素酶的效果好。
本试验以杜梨(Pyrus betulifolia)和‘新梨7号’为试材。初步建立了‘新梨7号’叶片离体再生体系，进而构建了‘新梨7号’叶片的遗传转化体系。对杜梨、‘新梨7号’PbPAT10基因进行克隆、测序，并在酵母和拟南芥中对杜梨PbPAT10基因进行了功能验证;同时，分别构建了杜梨和‘新梨7号’PbPAT10基因相应的CRISPR/Cas9表达载体，并获得了杜梨和‘新梨7号’抗性植株，旨在明确梨PbPAT10基因功能并为下一步获得具有矮生性状的梨突变体植株，为梨矮化密植的遗传改良研究提供新途径。其主要研究结果如下:
1.验证了杜梨PbPAT10基因与拟南芥该基因具有相同功能——矮生的功能
构建了杜梨PbPAT10基因的过表达的载体，并在拟南芥AtPAT10杂合突变体（T-DNA插入）中恢复试验。结果表明，转化杜梨PbPAT10的拟南芥株高与纯和突变体相比明显增高，接近拟南芥WT Col-0型的株高。在杜梨PbPAT10酶活性区域的第194的半胱氨酸进行了点突变。通过酵母互补试验发现梨点突变PbPAT10基因不能恢复酵母的活性，而正常的杜梨PbPAT10可以恢复酵母的活性，明确了杜梨PbPAT10基因与拟南芥PbPAT10基因功能类似。
2.初步建立了‘新梨7号’的遗传转化体系
初步建立了‘新梨7号’离体再生体系。通过调整6-BA、IBA、TDZ、NAA四种植物生长调节剂的浓度和配比，筛选出了适合‘新梨7号’再生的植物培养基配方:NN6922.2g/L+6-BA1.0mg/L+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L。
构建了‘新梨7号’的遗传转化体系。在转化体系中，将。新梨7号’叶片依次进行共培养、筛选培养。其培养基成分与时间依次为:共培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA1.0mg/L+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L，暗培养2-3天;筛选培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA1.0mg/L+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L+Kan20mg/L+Cef400mg/L，暗培养至出苗为止。
3.构建了梨PbPAT10基因CRISPR/Cas9表达载体，并获得梨抗性植株
成功构建r杜梨和‘新梨7号’的PbPAT10-2的CRISPR/Cas9表达载体。试验设计了两个靶点，用Overlapping PCR的方法分别构建了杜梨PbPAT10-2和‘新梨7号’PbPAT10-2基因的sgRNA表达盒，再将sgRNA表达盒和pCRISPR/Cas9P35S-N质粒经限制性内切酶BasⅠ和T4连接酶的共同作用下，得到2个以卡那霉素筛选为标记基因的PbPAT10-2的CRISPR/Cas9表达载体。利用杜梨子叶再生和‘新梨7号’叶片再生，经过农杆菌侵染，获到了5棵杜梨的抗性苗和4棵‘新梨7号’的抗性苗。
4.杜梨原生质体制备，确定了最适的酶解时间为12h，并且纤维素酶和果胶酶组合一起使用的效果要比离析酶和纤维素酶的效果好。