研究背景和目的支气管哮喘(简称哮喘)(bronchial asthma)是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。其重要的病理特征是慢性气道炎症和气道重构。慢性炎症是以多细胞及细胞组分参与的免疫反应;气道重构以气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cells, ASMCs)增生肥大、粘液腺增生、基底膜增厚、粘膜化生和新生血管的增生等为特征;但目前气道炎症和气道重构的机制未完全明确。近年的研究表明:气道平滑肌细胞不仅作为靶细胞参与气道重构,还作为免疫细胞参与气道炎症反应,因此,气道平滑肌细胞在哮喘的发生、发展过程中起着重要作用。Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)是一个新发现的高度保守而古老的天然免疫受体家族,它介导固有免疫和获得性免疫,可促使多种炎症因子和细胞因子释放,引发和加重炎症反应。国外的研究报道Toll样受体4(Toll like receptors 4,TLR4)在气道平滑肌细胞有表达,同时也证实外周血单核细胞与正常气道平滑肌细胞共同培养条件下,Toll样受体2(Toll like receptors 2,TLR2)及TLR4配体可诱导气道平滑肌细胞产生、释放细胞因子、趋化因子,但国内未见TLRs与气道平滑肌细胞关系的研究报道;而且国外的研究仅局限于正常气道平滑肌细胞表面TLRs激活与其分泌功能的关系并未涉及哮喘状态下气道平滑肌细胞的TLRs的作用研究。Sraat等人证实了激活TLR4可以促进血管平滑肌细胞的增殖,气道平滑肌细胞和血管平滑肌细胞都属于平滑肌细胞,在形态和功能上非常相似,因此,我们推测哮喘气道炎症中的众多炎症介质、细胞因子可激活ASMCs细胞膜上的TLRs,TLRs结合不同配体诱导哮喘气道平滑肌细胞产生炎症反应、释放炎症介质及促进细胞增殖、抑制凋亡,从而在哮喘的发生、发展过程中起重要作用。NF-ΚB是一种重要的、多向性的核转录因子,普遍存在于细胞质中的快速反应转录因子,位于TLRs下游信号通路的枢纽位置参与免疫反应及细胞增殖与分化等过程。哮喘治疗指南推荐糖皮质激素作为首选治疗气道炎症,地塞米松是一经典的糖皮质激素抗炎药,但其作用机制未明,因此,我们选用地塞米松治疗哮喘大鼠,探讨TLR4/NF-ΚB对哮喘大鼠气道重构的影响。综上所述,我们将建立大鼠哮喘模型,取肺组织,用图象分析软件测量气道壁厚度,分离气道平滑肌细胞进行细胞培养、利用RNAi技术这一基因沉默技术将TLR4基因沉默以及RT-PCR、Western blot、TUNNEL、ELISA等方法探讨TLR4对哮喘状态下气道平滑肌细胞的合成分泌功能及增殖凋亡的影响。为哮喘气道炎症和气道重构的发生机制提供新的理论,为寻找支气管哮喘治疗的新药物和新靶点奠定基础。方法本课题采用细胞培养、siRNA干扰技术、脂质体转染法、免疫组织化学染色、免疫细胞化学染色、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法及TUNNEL等检测方法,用肿瘤坏死因子-α(Tumor necosis factor-α,TNF-α)、NF-кB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)作为工具药,对体外培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞中TLR4调控细胞增殖和凋亡、合成分泌功能及TLR4表达进行研究;本课题还通过建立大鼠哮喘模型,采用Western印迹检测TLR4的蛋白表达水平、RT-PCR等方法检测TLR4的mRNA表达水平,免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡调节蛋白Bcl-2的表达水平,通过图像分析系统测定支气管壁厚度(WA/pi)、支气管壁平滑肌厚度(平滑肌面积/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi),对TLR4在哮喘大鼠气道平滑肌重构中的作用进行研究。1.结果(1)哮喘组ASMCs增殖反应明显高于正常组(P<0.01);哮喘组ASMCs培养上清中IL-5、IL-8的蛋白含量明显高于正常组(P<0.01)。(2)siRNA-TLR4转染哮喘大鼠气道平滑肌细胞的最佳时间为24h。2.1结果(1)siRNA-TLR4转染组的ASMCs增殖反应显著低于对照组(P<0.05);TNF-α组ASMCs增殖反应显著高于对照组、siRNA-TLR4转染组、TNF-α+siRNA-TLR4转染组(P均<0.01)。(2)siRNA-TLR4转染组和TNF-α+siRNA-TLR4转染组细胞凋亡率显著高于对照组(P均<0.01); TNF-α组ASMCs的凋亡率显著低于对照组、siRNA-TLR4转染组、TNF-α+siRNA-TLR4转染组(P均<0.01)。(3)对照组和TNF-α组IL-5、IL-8蛋白含量显著高于siRNA-TLR4转染组和TNF-α+siRNA-TLR4转染组(P均<0.01);TNF-α+siRNA-TLR4转染组IL-5、IL-8蛋白含量显著高于SiRNA-TLR4转染组(P均<0.01);TNF-α组蛋白含量显著高于对照组、siRNA-TLR4转染组、TNF-α+siRNA-TLR4转染组(P均<0.01)。(4)对照组和TNF-α组TLR4的mRNA和蛋白表达水平显著高于siRNA-TLR4转染组、TNF-α+siRNA-TLR4转染组(P均<0.01);TNF-α组TLR4的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组;siRNA-TLR4转染组与TNF-α组之间无显著差异(P>0.05)。2.2结果(1)TNF-α组ASMCs的增殖反应与对照组相比有显著差异(P<0.05), TNF-α+PDTC组、TNF-α+TLR4抗体组ASMCs增殖反应显著低于TNF-α处理组(P<0.01), TNF-α+PDTC组与对照组相比差异无显著性(P>0.05),TNF-α+TLR4抗体组ASMCs增殖反应显著低于对照组(P<0.01)。(2) TNF-α处理组细胞凋亡率显著低于对照组(P<0.01)。TNF-α+PDTC组、TNF-α+TLR4抗体组细胞凋亡率显著高于TNF-α组、对照组(P均<0.01)。(3)TNF-α组NF-ΚB、IL-5、IL-8蛋白含量显著高于对照组、TNF-α+PDTC组及TNF-α+TLR4抗体组(P均<0.01); TNF-α+PDTC组与TNF-α+TLR4抗体组之间差异无显著性(P>0.05)。(4)TNF-α组TLR4mRNA表达水平显著高于对照组及TNF-α+TLR4抗体组(P均<0.01); TNF-α+TLR4抗体组TLR4表达水平与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。(5)TNF-α组TLR4蛋白表达水平显著高于对照组及TNF-α+TLR4抗体组(P均<0.01);对照组TLR4表达水平显著高于TNF-α+TLR4抗体组(P <0.01).3结果(1)哮喘4周组、哮喘8周组的气道壁EOS计数均较正常对照组显著增加(P<0.01),且随哮喘天数的增加EOS计数也有增加的趋势,且两组间比较差异有显著性(P<0.05)。地塞米松治疗4周组与哮喘4周组相比较低,有显著差异(P<0.05),地塞米松治疗8周组较哮喘4周组、哮喘8周组、地塞米松治疗4周组相比较低,有显著差异(P<0.01),但与正常对照组相比仍较高(P<0.01),治疗8周组较治疗4周组相比较低,有显著差异(P<0.05)(2)哮喘4周组及哮喘8周组支气管壁厚度(WA/pi)、支气管壁平滑肌厚度(平滑肌的面积/pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N/pi)均较正常对照组明显增加(P<0.01),且随哮喘天数的增加上述指标亦有增加趋势,哮喘8周组较哮喘4周组明显增加(P<0.01);治疗4周组与哮喘4周组、治疗8周组与哮喘8周组相比显著降低(P<0.01),但治疗组与正常组相比仍较高(P<0.01)。(3)哮喘4周组、哮喘8周组的气道反应性均高于正常对照组(P<0.01)。治疗4周组气道反应性较哮喘4周组下降,有差异(P<0.05),哮喘8周组气道反应性较哮喘4周组明显增高(P<0.01)。治疗8周组气道反应性较哮喘4周组、哮喘6周组、治疗4周组均显著降低(均为P<0.01),但仍高于正常对照组(P<0.01)。(4)哮喘4周组、哮喘8周组的TLR4及NF-ΚB的mRNA水平明显高于地塞米松治疗4周组、地塞米松治疗8周组及对照组(P<0.01);TLR4及NF-ΚB的mRNA水平随哮喘天数的增加而明显增加(P<0.01);地塞米松治疗4周组的TLR4及NF-ΚB的mRNA水平明显高于地塞米松治疗8周组(P<0.05)。(5)哮喘4周组、哮喘8周组的TLR4蛋白质表达明显高于地塞米松治疗4周组、地塞米松治疗8周组及对照组(P<0.01);哮喘8周组的TLR4蛋白质表达高于哮喘4周组(P<0.05), TLR4蛋白水平随哮喘天数的增加而明显增加;地塞米松治疗8周组TLR4蛋白质表达高于对照组(P<0.05)。(6)哮喘4周组、哮喘8周组PCNA的蛋白表达量均明显高于正常对照组(P<0.01),且哮喘两组间上述指标差异有显著性(P<0.05);地塞米松治疗8周组PCNA的蛋白表达量明显低于哮喘4周组、哮喘8周组及地塞米松治疗4周。哮喘4周组、哮喘8周组及地塞米松治疗4周组Bcl-2的蛋白表达量与对照组相比明显增高(P<0.01);地塞米松治疗4周Bcl-2的蛋白表达明显高于地塞米松治疗8周(P<0.05)。结论1、siRNA-TLR4转染哮喘大鼠ASMCs的最佳转染时间是24小时。2、TLR4可能参与调控哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡和IL-5、IL-8合成、分泌,从而参与气道重构和气道炎症的发生、发展过程。3、TLR4可能通过NF-ΚB传递生物信号调控哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡和合成、分泌,在哮喘的气道重构和气道炎症中起重要作用。4、TLR4可能通过NF-ΚB参与哮喘大鼠模型的气道平滑肌增殖凋亡的调控,地塞米松可能通过抑制TLR4表达,下调NF-ΚB活性抑制细胞增殖反应,促进细胞凋亡,改善气道重构。