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蚬壳花椒(Zanthoxylum dissitum Hemsl)是我国是十分珍稀的药用植物,因其根、茎、叶均可入药,有解毒消肿、散瘀止痛、活血化瘀的功效,目前主要被用于多种中成药生产原材料。然而,由于蚬壳花椒在自然条件下繁殖率低,生长周期长、生长条件苛刻等因素,导致蚬壳花椒自然资源十分有限。蚬壳花椒种子含油率高,在萌发前期主要利用种子中贮藏的脂肪物质作为主要能源物质,通过乙醛酸循环途径将脂肪物质转化碳源。本研究以赤霉素处理的萌发过程中的蚬壳花椒种子为研究对象,利用基因克隆和qRT-PCR等方法,从分子水平上研究了蚬壳花椒种子萌发过程中异柠檬酸裂解酶基因的动态表达情况,揭示了蚬壳花椒种子萌发初期种子油脂的动员规律,也为解决蚬壳花椒种子萌发率低下的问题提供了一定的参考依据。研究工作取得如下进展:(1)通过实时荧光定量PCR技术测定蚬壳花椒种子GA3处理组和清水处理组在不同萌发时期6种常用管家基因GAPDH,ACT,UBQ5,CYP,TUA,18SrRN 的表达量情况,并借助NormFinder,Best-keeper和geNorm三种常用软件分析评估,最后筛选出适合蚬壳花椒种子萌发前期内参基因为ACT和UBQ5。(2)用赤霉素和清水分别处理蚬壳花椒种子,利用qRT-PCR检测ZdOCL基因在不同萌发时期的表达情况。结果表明:相对于清水处理组种子,GA3处理的蚬壳花椒种子在萌发第一天,ZdICL表达量处于较低的水平。这可能在种子萌发前期GA抑制了油脂动员代谢,从而降低了脂肪酸动员过程中β-氧化产生的H2O2,避免了种子在吸胀过程中受到自由基的氧化性伤害。萌发第二天开始ZdICL表达量明显上升,这是由于GA通过降解ABA促进了种子萌发过程中各种代谢途径趋于活跃,包括脂肪动员代谢增强为种子萌发提供碳源与能量,同时种子中各种抗氧化酶的抗氧化能力也增强,可以避免脂肪酸动员过程中β-氧化产生过量H2O2。说明GA可能在蚬壳花椒萌发前期参与抑制种子油脂动员,从而减少脂肪动员后脂肪酸β-氧化产生过量H2O2,避免对种子造成氧化性伤害,保护了蚬壳花椒种子萌发后期的正常萌发。(3)以蚬壳花椒种子cDNA为模板,通过PCR扩增得到ZdICL基因的CDS全长序列,其片段长度为1728 bp,编码575个氨基酸残基,分子量为64.46 KD,与其他物种的ICL基因进行同源比对,发现与甜橙的亲缘关系最近。蛋白预测分析表明ZdICL基因编码的氨基酸序列含有TIM_phosphate_binding超家族保守结构域和一段氨基酸序列为KKCGHM的六肽保守域。在线软件预测ZdICL基因编码蛋白主要位于细胞质内,为一种疏水性可溶性蛋白。(4)测序鉴定后的pMD-18T-ZdICL重组质粒经BamHI和XhoI双酶切,连接到pET-28a(+)表达载体中,经PCR鉴定和酶切验证,构建了原核表达载体pET-28a-ZdICL。将构建好的表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,用诱导剂IPTG进行诱导表达。通过对诱导温度和诱导时间的优化,发现在20 ℃,1 mM IPTG诱导19 h产生大量pET-28a-ZdICL融合蛋白。利用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,透析浓缩后测得ZdICL目的蛋白的浓度为610 μg/ml,活性为362.84 nmol/min/mg prot。