端粒是位于线状染色体两端的DNA-蛋白质帽子结构,能够保证遗传信息以及染色体正常的生理功能。端粒酶作为一类具有逆转录作用的酶,能够决定端粒的长短和活性大小。端粒与端粒酶在细胞衰亡、肿瘤发生以及干细胞能力维持等生命活动中都至关重要,而表达和调控机制的紊乱很可能导致癌症相关疾病的发生。在大部分恶性肿瘤细胞中端粒酶都会过表达,阻止端粒长度缩短和缺失,使癌细胞永生化。由此端粒酶可作为重要的肿瘤标志物,为癌症早期诊断提供依据和相应的治疗靶点,它的检测分析具有广泛的应用价值。本论文依据端粒酶扩增的基本原理,设计相应的核酸纳米结构和分子识别探针,构建基于功能化纳米材料介导的信号放大体系,以电化学和荧光技术作为关键检测手段,开发超灵敏生物传感器,开展针对端粒酶活性相关的定量检测和细胞内成像研究,具体内容如下:1.我们首先利用纳米材料作为信号分子,设计了无PCR参与的基于电化学传感技术的端粒酶活性分析方法。在这项研究里,使用未修饰的金纳米材料(AuNPs)和电化学伏安法定量分析从HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。在金电极上,端粒酶可以利用硫醇修饰的端粒酶底物(TS)引物和脱氧核糖核苷酸(dNTPs)的混合物,特异性地促进含有重复核苷酸序列(TTAGGG)n的单链DNA(ssDNA)的延长。在TS引物与阻断剂DNA杂交后,纳米金粒子被ssDNA延伸部分暴露的含氮碱基捕获,并且通过差分脉冲伏安法(DPV)来具体量化端粒酶活性。在分析电化学信号后,获得20到2000个细胞的线性检测范围。这种简单的分析机制的检测极限是20个细胞。此方法无需PCR参与,快速且简单,非常适合在体外灵敏的评估细胞提取物中的端粒酶活性。2.我们接着开发了一种更稳定精确的双信号比率型电化学传感器,设计核酸的发夹结构用于端粒酶活性的超灵敏分析。发夹结构的DNA探针在其5’末端用亚甲基蓝(MB)分子标记后首先被结合在金电极界面上。然后与二茂铁标记(Fc)的端粒酶底物引物(Fc)进行杂交。随着端粒酶的催化反应,重复产生(TTAGGG)n的序列,能够与发夹DNA其余部分结合,进而触发探针的构象转导,打开发夹结构。因此,MB信号从电极表面释放,检测到的氧化峰值电流(IMB)降低。同时,Fc信号不受构象变化影响,保持相对稳定,峰值电流(IFc)可以用作内部对照,提高信号输出的稳定性和准确性。这种智能结构设计可以实现可靠的目标识别,获得的结果表现出出色的分析性能,非常适合低浓度目标物的检测。实验结果发现IMB/IFc与端粒酶浓度对数线性相关,检测限度极低。这种基于核酸结构变化和比率型信号输出的方法,可以成为一种强有力的分析端粒酶活性的实用工具,也可以作为开发其他核酸分析的多功能工具。3.端粒酶催化端粒延伸反应并添加DNA重复序列,诱发癌症或其他疾病,除了体外检测,其细胞内成像分析也具有重大应用价值。因此,开发可靠和方便的端粒酶原位监测方法对于恶性肿瘤的临床诊断至关重要。然而,大多数用于细胞内端粒酶活性测定的电流探针都面临不可避免的假阳性干扰。在这项研究中,我们设计了一种核酸四面体结构,并利用荧光共振能量转移(FRET)效应,来高灵敏度的监测和分析细胞内基于端粒酶表达的自由扩增程序。其中,由DNA四面体作为结构基底和发光DNA作为有效识别序列,构建DNA纳米探针,以实现端粒酶的体外传感检测和细胞内成像,并且避免假阳性干扰的问题。端粒酶可以使其底物引物延伸产生重复序列,发生链置换反应并改变核酸探针的构型,两端标记荧光团的发光DNA被释放游离出来,信号分子之间的距离增加导致荧光的恢复。此方法基于显著的FRET效应建立了简单比率传感器,检测限度可以达到单细胞水平。这种检测系统可以在端粒酶抑制剂的筛选分析中得到应用,在抗癌药物发现中发挥作用。4.端粒酶和miRNA在肿瘤细胞中含量较高,已被公认为常见的肿瘤检测标志物。我们又设计了基于miRNA触发的DNA酶步行器,与纳米金(AuNPs)探针结构相结合,用于端粒酶活性的逻辑门传感分析。通过链置换反应,目标miRNA打开两个发卡结构,循环扩增形成双足DNA酶步行器。在AND逻辑门实验中(实验A),端粒酶的存在使引物(Tp)被延长,与锁定链结合。双足DNA酶和Mn2+与底物链结合,发生催化剪切作用,被AuNPs抑制的羧基荧光素信号(FAM)释放到溶液中,荧光恢复。在两种目标物或任何一种目标物不存在时,检测体系的荧光皆无法恢复。在OR逻辑门实验中(实验B),miRNA触发的双足DNA酶可以单独打开AuNPs探针上的发卡结构,在Mn2+作用下,将荧光分子释放出来。端粒酶产生的延伸产物,可以与AuNPs探针上含有FAM的锁定链结合形成双链,释放到溶液中产生荧光。单一目标物存在下,荧光信号皆可恢复,两种目标物存在下,荧光强度增加。除此之外,含有信号分子的AuNPs探针复合物、载有DNA酶和TP引物的二氧化锰(MnO2)纳米片,可被细胞自主摄取,传递到细胞中,用于细胞内成像分析。该方法使用生物逻辑门和DNA酶步行器,极大地提高了荧光探针检测的适用性和灵敏度,已成功应用于端粒酶和miRNA的体外检测和细胞内成像研究,对于临床诊断来说具有重要意义。5.在更进一步的研究中,我们策略性地制造了多功能纳米结构TDNs-Flare探针,来同时灵敏地检测端粒酶和miR-21这两种肿瘤标志物,以及进行相应的细胞内生物成像研究。TDNs-Flare探针主要是由金纳米颗粒(AuNPs)修饰的四面体DNA纳米结构(TDNs)作为基质,包含Flarel(Cy5)和Flare2(CDg)两种不同的反应性应答信号。在存在靶标的情况下,不完全互补的DNA链Flare会竞争性地从四面体框架中被置换下来,从而导致荧光信号的恢复。CDg荧光对应的miR-21线性检测范围从1 fmol到100 pmol,而Cy5荧光可以完成低至10个HeLa细胞的端粒酶浓度分析,动态分析范围从10到5000个HeLa细胞。此外,抗癌药物(Dox)在插入DNA双链后,会随目标物的识别和结合,而释放到细胞中发挥作用。这项研究表明TDNs-Flare探针是定量测定癌症生物标志物的很好的选择,并且已成功在研究中用于响应性生物成像。该纳米结构不仅克服了在细胞水平上同时检测多种生物标志物的障碍,而且在DNA装载抗癌药物的细胞内传递方面有着广阔的应用前景。