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目的：随着中国人口老龄化加剧,骨质疏松发病率正逐年增加,已成为举世瞩目的公共卫生事件。对于骨质疏松的治疗,除了合理用药,适当运动必不可少。然而由于目前对骨骼力学感受机制的不明确,导致临床医生无法正确指导患者合理运动而促进其康复。本课题应用自制体外流体剪切力加载系统,以ERK5为靶分子,研究成骨细胞应力信号传导机制,结果为骨量减少性疾病治疗药物的开发,以及临床正确指导患者合理运动提供理论依据。方法：对MC3T3-E1细胞和MG-63细胞加载不同强度与时间长度的流体剪切力,通过Westernblot、包疫荧光化学等方法研究流体剪切力刺激ERK5活化的机制。应用德国Boehringer Ingelheim公司Snow博士惠赠的MEK5阻断剂BIX02188和BIX02189阻断ERK5活化,通过MTT、Westernblot和免疫荧光化学等方法研究ERK5在循环流体剪切力促进成骨细胞增殖过程中的作用机制。结果：对体外培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1加载12dyn/cm2流体剪切力,随着加载时间的延长,ERK5活化水平上调,在45min左右达到高峰,用MG-63细胞重复上述实验得到相似的结果。对成骨细胞加载不同时间长度(30、45和60min)、不同强度的流体剪切力(6、12和18dyn/cm2),发现强度为12dyn/cm2的流体剪切力为最佳强度。同时发现,流体剪切力可在较短时间内(5min)刺激成骨细胞细胞骨架重组,在90min左右,细胞骨架重组率达90%以上,然而,90min后,细胞骨架出现破碎,并出现细胞片状脱落,细胞骨架重组率下降至69.02±4.71%。在流体剪切力加载前或加载中加入细胞骨架微丝阻断剂细胞松弛素D(1μ M)可明显抑制细胞骨架重组,并下调ERK5活化水平,而加入细胞骨架微管阻断剂诺考达唑(0.1μ M)仅下调ERK5活化水平,对细胞骨架重组无影响,在流体剪切力加载前和加载中同时加入细胞松弛素D和诺考达唑几乎完全阻断ERK5活化(活化水平仅为12.11±1.93%)。此外我们也检测到阻断细胞骨架成分可显著下调上游FAK磷酸化水平。细胞加载流体剪切力后,出现磷酸化的ERK5向细胞核区域浓集,而阻断细胞骨架成分对ERK5细胞核浓集无影响。BIX02188(10μM)和BIX02189(10μM)均可显著抑制ERK5活化,在2h时阻断作用达到高峰,2h后ERK5活化几乎完全阻断。成骨细胞孵育2hBIX02188或BIX02189后,在无血清培养基中培养不同时间后加入ERK5活化剂(200μ M H2O2),发现培养4h后,仅有微弱的ERK5活化,而4h内均未检测到ERK5活化。MTT结果证实,流体剪切力可促进成骨细胞增殖,阻断ERK5活化可显著抑制增殖作用,阻断后加载流体剪切力可重新上调成骨细胞增殖,利用BrdU整合实验计算BrdU阳性细胞比率也得到相似结果。流体剪切力上调ERK5活化,同时促进下游AP-1和cyclin D1表达,抑制p-16表达,而阻断ERK5活化可抑制AP-1和cyclin D1表达,促进p16表达。与持续流体剪切力相比,循环流体剪切力更有利于促进ERK5活化和cyclin D1表达。结论：流体剪切力可活化成骨细胞ERK5,细胞骨架重组在该过程中发挥重要作用,流体剪切力可能通过细胞骨架重组促进细胞膜粘附分子FAK磷酸化活化ERK5。阻断细胞骨架重组可显著下调ERK5磷酸化水平,但是对磷酸化的ERK5细胞核转位没有影响。细胞骨架在流体剪切力刺激下可迅速重组,然而长时间的流体力学刺激,即使是在生理强度范围内,也会导致细胞骨架破碎。循环流体剪切力可调控ERK5活化,促进AP-1和cyclin D1表达,同时抑制p-16表达促进成骨细胞增殖。与持续流体剪切力相比,循环流体剪切力更有利于促进成骨细胞增殖。MEK5阻断剂BIX02188和BIX02189均可显著抑制ERK5磷酸化,并且该阻断时间至少持续4h。综上所述：ERK5是成骨细胞力学信号传导机制中的重要靶分子,在流体剪切力调控成骨细胞增殖过程中发挥重要作用。