至今玻璃化冷冻人类不同状态卵母细胞及囊胚出生的婴儿全世界已经有一千多例,但是由于对出生婴儿缺乏终生追踪资料及对细胞冻融过程中发生的变化缺乏全面了解,目前还有许多问题尚未解决,其临床有效性和安全性仍是人们关注的焦点。本文就目前尚未解决的问题从以下四个方面进行了研究,从基础到临床系统评价玻璃化冷冻人类卵母细胞及囊胚的安全性,旨在为临床应用提供有利的理论和临床依据,目前国内外尚未见相关报道。　　 第-部分玻璃化冷冻小鼠成熟卵母细胞的基础研究　　 目的:　　 寻找冷冻小鼠成熟卵母细胞最低浓度的乙二醇(Ethylene glycol,EG)和最佳冷冻时机,探讨其可能的机制。　　 方法：　　 1.不同浓度EG玻璃化冷冻小鼠成熟卵母细胞。随机分7组,分别经一步、两步、三步法5％EG与10％EG冷冻。随机分5组,分别经不同温度、时间及蔗糖浓度的10％EG冷冻。随机分4组,分别经两步法10％EG、15％EG及20％EG冷冻。冻存1个月后解冻,存活的卵母细胞孵育2h后行(Intracytoplasmic sperminjection,ICSI)受精,观察受精、卵裂及胚胎发育情况。　　 2.小鼠成熟卵母细胞按取卵后不同冷冻时间随机分3组,Polscope成像系统观察并测量纺锤体密度(用阻滞值Retardance值表示)、极体与纺锤体角度。入选标准:选择冷冻-解冻后均有纺锤体的卵母细胞进行冷冻前后各值的测量及ICSI受精。　　 结果：　　 1.不同浓度EG对小鼠成熟卵母细胞复苏结局的影响。三组5％EG的复苏率均为0；三组10％EG之间的存活率、囊胚率比较均无统计学差异(P>0.05),但是均明显低于对照组(P<0.01,P<0.05)。五组间的存活率、受精率、卵裂率及优质胚胎率比较,均无统计学差异(P>0.05)。组1与组3的存活率均明显低于组2和对照组(P<0.01)。　　 2.解冻后极体与纺锤体的角度均大于冷冻前(P<0.01)；B组和C组解冻后纺锤体的Retardance值均低于冷冻前(P<0.05),而A组则相反。B组冷冻前纺锤体的Retardance值显著高于其它两组(P<0.05),而A组解冻后纺锤体的Retardance值、存活率和卵裂率均明显高于其它两组(P<0.05,P<0.01)。　　 结论：　　 1.两步法15％EG及取卵后2h是玻璃化冷冻小鼠成熟卵母细胞中冷冻效果最佳的浓度和时机。　　 2.新鲜小鼠成熟卵母细胞的纺锤体变化有时间依赖性；冻融卵母细胞的质量与解冻后纺锤体密度呈正相关,与极体与纺锤体角度无相关性。　　 第二部分玻璃化冷冻人类不同状态卵母细胞的安全陛研究　　 目的:　　 探讨玻璃化冷冻安全性最高的人类卵母细胞及可能的机制。　　 方法：　　 1.按体外成熟时间分为:18h体外成熟组(A组)；24h体外成熟组(B组)；48h体外成熟组(C组)。　　 2.按不同成熟阶段分为:GV组(Germinal vesicle,GV)和MI组(MetaphaseI,MI)。　　 3.按不同状态分为:体内成熟组；体外成熟组；未成熟组。　　 以上三组实验均通过Polscope成像系统观察并测量冷冻前后纺锤体密度、极体与纺锤体角度及透明带内层厚度(Zona pellucida thickness,ZPT)和密度(Zona pellucida density,ZPD),并进行胚胎发育评估。其中第3组实验的胚胎进一步采用荧光原位杂交法进行染色体非整倍体的筛查。　　 4.采用单细胞凝胶电泳试验检测不同状态卵母细胞冻融后的DNA损伤,分为:体内成熟组,体外成熟组,未成熟组。　　 结果：　　 1.三组解冻后极体与纺锤体的角度、透明带内层ZPD值均大于冷冻前,前者B组有统计学差异(P<0.05),后者C组有统计学差异(P<0.05)。B组与C组解冻后纺锤体的Retardance值均低于冷冻前(P<0.05)。冷冻前纺锤体的Retardance值B组显著高于其它两组(P<0.05),而解冻后A组纺锤体的Retardance值及优质胚胎率、囊胚形成率均高于其它两组(P<0.01,P<0.05)。　　 2.冷冻GV组的存活率显著高于冷冻MI组(P<0.05),而前者的体外成熟率显著低于后者(P<0.01)；两冷冻组解冻后透明带内层ZPD值高于冷冻前(P<0.05)。　　 3.两成熟组解冻后极体与纺锤体角度、纺锤体的Retardance值均大于冷冻前,前者体内成熟组有统计学差异(P<0.05),后者体外成熟组有统计学差异(P<0.05)；三组解冻后透明带内层ZPD均显著高于冷冻前(P<0.05)。未成熟组解冻后纺锤体率、纺锤体的Retardance值及卵裂率均显著低于其它两组(P<0.05)。三组胚胎的非整倍体率无统计学差异(P>0.05)。　　 4.体内成熟组彗星细胞率显著低于其它两组(P<0.01)；未成熟组彗星细胞拖尾长度显著高于其它两组(P<0.05)。　　 结论：　　 1.冻融人类不同状态卵母细胞的质量与解冻后纺锤体密度呈正相关,与透明带内层ZPT和ZPD、极体与纺锤体角度无相关性。建议临床选择解冻后纺锤体密度高的卵母细胞形成的胚胎进行移植。　　 2.本研究证实玻璃化冷冻没有增加冻融卵母细胞胚胎染色体的非整倍体率,但是Polscope观察冻融人类卵母细胞纺锤体出现率及密度不能预测其胚胎非整倍体的发生,尚需产前诊断进一步评估胎儿的安全性。　　 3.人类体外成熟卵母细胞的纺锤体变化有时间依赖性。冷冻18h体外成熟卵母细优于24h和48h体外成熟卵母细胞。冷冻MI期与GV期卵母细胞发育潜能无明显差异。　　 4.玻璃化冷冻人类体内成熟卵母细胞的安全性最高。其次冷冻体外成熟卵母细胞优于未成熟卵母细胞,后者胚胎发育潜能低的因为可能与DNA损伤最大有关。但是本研究中体内成熟的卵母细胞样本量较小,尚需加大样本量证实。　　 第三部分玻璃化冷冻人类成熟卵母细胞的临床结局　　 目的:　　 探讨不同冷冻时机及解冻方法与妊娠结局的关系和临床应用的安全性。　　 方法：　　 回顾性分析本中心2007.7～2009.5接受成熟卵母细胞冷冻-解冻的30例不孕症患者的一般临床资料,追踪随访妊娠结局及胎儿出生情况。所有患者分三组:取卵后4-5h冷冻且常规法解冻(A组)；取卵后2h冷冻且常规法解冻(B组)；取卵后2h冷冻且改良法解冻(C组)。　　 结果：　　 1.临床资料各值的比较,均无统计学差异(P>0.05)。　　 2.B组和C组的卵母细胞存活数、移植周期率均明显高于A组(P<0.01,P<0.05)。C组的胚胎种植率、临床妊娠率均明显高于B组(P<0.01,P<0.05)。　　 3.B组1例临床妊娠2个月后胚胎停止发育。C组9例临床妊娠(包括3例赠卵移植,5例供精移植,1例自身移植),其中1例赠卵移植在孕4个月晚期流产。8例已顺利分娩五男婴四女婴,染色体及发育均正常,每解冻卵母细胞活产率5.9％(8/135)。　　 4.C组中用于自体、赠卵及供精移植的平均年龄、存活卵母细胞数,受精率、胚胎种植、临床妊娠率之间比较,均无统计学差异(P>0.05)。　　 结论：　　 1.取卵后2h冷冻及改良解冻方法是提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞临床妊娠的关键,可以成功应用于临床赠卵、供精及自体移植。　　 2.目前本中心已经有8例妊娠顺利分娩健康婴儿,经检索为河南省首例冷冻卵母细胞出生婴儿,证实此项技术的安全性及有广阔的应用前景:是进行长期赠卵的一项较好方案;是睾丸取精失败患者的有效补救措施。　　 第四部分玻璃化冷冻人类不同阶段囊胚的初步研究　　 目的:　　 探讨玻璃化冷冻人类囊胚的最佳阶段和方法。　　 方法：　　 选取本中心2009.9～2010.2行IVF/ICSI的患者因质量差或异常受精的废弃胚胎,继续培养至不同发育阶段质量较好的囊胚。将早期囊胚和扩张期囊胚随机分为:穿刺组、未穿刺组和对照组。解冻后囊胚孵育2h、12h及16h观察并记录各组囊胚的复苏、重新扩张及孵出结果。TUNEL进一步检测囊胚细胞凋亡情况。　　 结果：　　 1.早期囊胚穿刺组与未穿刺组的囊胚扩张率、囊胚孵出率均明显低于,且凋亡细胞数明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。　　 2.扩张期囊胚穿刺组的囊胚复苏率明显高于未穿刺组(P<0.01),穿刺组与对照组的囊胚扩张率明显高手,且凋亡细胞数明显低于未穿刺组(P<0.05)。　　 3.穿刺组中扩张期组的囊胚扩张率、囊胚孵出率均明显高于,凋亡细胞数、囊胚扩张时间均明显低于早期组(P<0.01,P<0.05)。　　 结论：　　 人工穿刺显著提高了扩张期囊胚的解冻效果。玻璃化冷冻扩张期囊胚优于早期囊胚。但是由于本研究的囊胚均来自劣质或异常受精胚胎,尚不能完全代表正常优质胚胎的结果,其临床有效性尚需证实。