背景与目的胶质瘤(Glioma)是成人恶性脑肿瘤的主要类型,其恶性程度较高的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是最为常见且难以治愈的原发性脑部肿瘤。目前临床上对胶质母细胞瘤的首要治疗方式为手术切除治疗,但由于其高度侵袭性、弥漫性生长特性,单纯应用手术几乎无法将其完全切除,患者术后预后不佳,病情容易反复,故术后放化疗已成为一种积极的辅助治疗方式。研究发现,手术全切结合放化疗治疗可有效延长患者的生存时间,但即便如此,患者5年生存率仍然低于10%。同时,常规的脑胶质瘤化学治疗药物毒副作用较强,极易对中枢神经系统以至整个机体造成损伤。且由于人体特殊结构血脑屏障的存在,一些药物难以通过,化疗效果难以达到理想水平,对患者的术后康复以及生活质量的提高造成了极大影响。因此,寻求一种可以有效抑制肿瘤细胞生长,抑制肿瘤细胞侵袭以及安全无毒副作用的抗胶质瘤药物具有十分重要的临床意义。白藜芦醇(resveratrol,Res),3,5,4’-三羟基-反-二苯乙烯,是一种来源于决明、桑葚等植物的多酚类化合物。研究发现,白藜芦醇具有良好的抗炎、抗肿瘤、预防心血管疾病等功效,来源广泛,无毒副作用,在肿瘤的预防以及治疗方面具有十分独特的作用。活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)为线粒体氧代谢的副产物,主要包括一些较高活性的离子以及分子。一般情况下,机体内活性氧水平由体内的抗氧化物质维持于相对平衡状态,主要包括抗氧化酶类,如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和具有同样作用的谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GPx)等,还有一些小分子物质如维生素A、C和还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)等。目前已有研究证实,ROS可以作为信号分子介导细胞信号转导,作用于线粒体,进一步诱发细胞凋亡。因此通过应用药物使肿瘤细胞内氧化还原平衡打破,增加细胞内ROS水平,导致细胞氧化损伤并诱导凋亡,可能会作为癌症治疗的另一途径。较多文献报道,白藜芦醇在正常细胞内具有较为显著的抗氧化活性。但对癌症细胞的有关研究却少有报道。同时,本实验室的一些研究发现,白藜芦醇可对卵巢癌细胞的生长产生明显抑制作用,且电镜下观察到大量球形线粒体。针对此现象,我们猜测白藜芦醇可能会增加癌细胞内氧化应激状态,这可能是由于癌细胞内对白藜芦醇的代谢机制不佳所致。鉴于上述原因,我们认为氧化应激状态可能是确定胶质母细胞瘤细胞白藜芦醇敏感性的可能因素。为此,本实验主要目的为:1.探究U251、LN428对白藜芦醇药物的敏感性差异。2.电镜下观察U251、LN428经白藜芦醇处理后线粒体变化。3.检测白藜芦醇处理后U251、LN428细胞中ROS的表达水平,相关抗氧化酶表达情况。4.探究线粒体介导的凋亡通路相关的caspase蛋白在U251、LN428加药处理前后的表达水平。5.检测白藜芦醇相关代谢酶SULT 1A1,1C2在U251、LN428加药处理前后的表达水平。方法:本文以一对白藜芦醇敏感和耐药的胶质母细胞瘤细胞系U251和LN428细胞为研究对象,采用MTT法研究白藜芦醇对同一类型肿瘤不同细胞系的敏感性差异;通过HE染色、TUNEL荧光染色以及通过透射电镜(TEM)观察药物处理后细胞凋亡的形态学变化;DCFH-DA染色后,采用流式细胞仪和荧光显微镜检测白藜芦醇处理后ROS水平;Western-blotting对caspase蛋白进行分析,研究白藜芦醇诱导细胞凋亡的作用机制;为了进一步探究胶质母细胞瘤细胞对白藜芦醇的敏感性差异,采用Western-blotting及免疫细胞化学(ICC)研究白藜芦醇作用后,相关抗氧化酶SOD2,catalase以及白藜芦醇相关代谢酶SULT1A1和SULT1C2的变化。结果:1.U251细胞系在白藜芦醇处理后,细胞拉丝、皱缩,生长增殖受到显著抑制,细胞数量大幅降低,TUNEL阳性表达明显。LN428细胞系在白藜芦醇处理后,细胞形态基本未发生变化,细胞数量未受到明显的抑制,TUNEL表达阴性。2.U251与LN428正常组细胞结构完整,线粒体呈现为棒状,形态规则饱满,线粒体嵴清晰且排列整齐;白藜芦醇处理48h后,LN428细胞系结构和线粒体无明显形态学改变,而U251细胞内表现为球形线粒体出现,线粒体内的嵴扩张,模糊不清甚至消失,可见空泡形成,细胞核破碎,向边界凝集。3.DCFH-DA探针细胞爬片荧光染色结果及流式细胞仪检测发现,白藜芦醇处理后,U251中绿色荧光强度增加,24h达到最强,而LN428细胞的荧光强度并未发生变化。ICC及Western Blotting检测发现,白藜芦醇处理的U251细胞中SOD2和CAT表达下降,呈现时间相关性,而LN428细胞的SOD2和CAT水平没有明显变化,表明与白藜芦醇处理无关。4.Western Blotting检测U251和LN428细胞中pro-caspase-9和-3,active-caspase-9和-3的表达水平。经白藜芦醇处理48h后,U251细胞中pro-caspase-9和-3的水平略有下降,而活化的caspase-9和-3明显上调。LN428细胞的上述参数几乎保持不变,与白藜芦醇处理无关。5.U251胶质瘤细胞系经白藜芦醇处理前SULT 1A1和1C2相对表达较弱,经白藜芦醇处理后,SULT1A1以及SULT1C2表达略有增高,但其整体表达水平低于LN428胶质瘤细胞系。LN428胶质瘤细胞系SULT1A1以及SULT1C2相对表达较强,经白藜芦醇处理后,SULT1A1以及SULT1C2的表达均有一定程度增强。结论:1.白藜芦醇可以增加其敏感细胞系U251细胞中ROS的产生,引起氧化应激,进而诱导凋亡。2.白藜芦醇下调了其敏感细胞系U251细胞中SOD2和CAT的表达。3.白藜芦醇诱导GBM细胞凋亡的机制可能是通过增加ROS的产生,造成线粒体氧化损伤,最终引起caspase-9和caspase-3激活。4.白藜芦醇敏感性差异的原因可能与其代谢酶SULTs表达水平成负相关,即代谢酶表达越高,白藜芦醇敏感性越差。