研究背景:人脑胶质瘤是严重危害人类健康的恶性肿瘤,是神经系统中最常见的原发性脑恶性肿瘤,约占所有原发性脑部恶性肿瘤的80%。其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是胶质瘤中恶性程度最高的肿瘤,主要是由于GBM的肿瘤细胞异质性强,侵占血管网、神经纤维和蛛网膜间隙,广泛向远处浸润生长,通过外科手术很难做到彻底根除,即使辅以放疗和化疗,其复发率依然很高。目前胶质母细胞瘤患者的中位生存期依然只有约15个月。究其原因,一方面由于胶质瘤本身的特性决定了其难治性,另一方面,目前的治疗手段还远远不能满足临床的需求。临床的治疗中还存在诸多困难,例如,外科手术既要力争保留功能,又要做到最大化切除;化疗药物既要克服耐药及副作用,又要做到精准有效抗击肿瘤;放射治疗既要完善靶区定位技术,又要避免引起不可逆的放射性损伤。近年来,随着科研人员对胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的发病机制及肿瘤细胞特性的不断深入研究,各种新型药物逐渐被开发出来,这给广大饱受胶质瘤困扰的患者带来了福音。磷酸酶与激酶参与调控细胞中各种蛋白质的磷酸化与去磷酸化,进而调控包括细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡等一系列基础生命活动。有研究表明,磷酸酶在肿瘤中发挥重要作用,通过干预磷酸酶的表达可以达到抑制肿瘤的作用,有望成为肿瘤治疗的新手段。蛋白磷酸酶2A（Protein Phosphatase 2A,PP2A）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,其由三个亚基组成:结构亚基A、调节亚基B、催化亚基C,PP2A现在已被确认与多种癌症相关,并被认为是开发新的癌症疗法的有吸引力的靶点。在肝癌细胞中,PP2A的C亚基高表达往往提示肝癌的恶性程度高、患者的整体预后差。在胰腺癌中,PR55α（PP2A中B亚基的一种同源异构体）的高表达被证明能够促进肿瘤的增殖及迁移等能力,PP2A还可以通过诱导细胞周期阻滞进而有助于肿瘤细胞产生抗药性,这些研究证明了 PP2A对肿瘤生长发育的积极作用,这就使研究者们联想到或许可以通过抑制PP2A活性来达到抗击肿瘤的目的,并可能成为新的有效的抗肿瘤治疗策略。作为PP2A天然抑制剂的冈田酸及斑螯素已被证明具有强大的促肿瘤细胞凋亡的特性,但其本身是来自动物体内的毒素,直接作用于人体会产生强大的毒性,这使得它们的临床应用受到极大的限制。最近,美国的LIXT公司研发了一种斑螯素的衍生物LB-100,它可以竞争性抑制PP2A的活性,并在各种人工合成的PP2A抑制剂中具有毒性最小,研究最多,临床转化潜能最大的优点。在包括胶质母细胞瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌的研究中表现出强大的抗肿瘤作用,其作用机制涉及逆转PP2A引起的细胞周期阻滞、增加肿瘤放化疗的敏感性、诱导肿瘤细胞进入异常的有丝分裂过程并导致其死亡。但是关于LB-100对肿瘤细胞凋亡及侵袭作用的研究报道并不多,而对侵袭性极强的GBM来说,LB-100是否能抑制其侵袭能力?这引起了我们极大的研究兴趣。研究目的:本研究拟通过体外实验来探讨PP2A抑制剂LB-100对胶质母细胞以及CD133+胶质瘤干细胞的侵袭及凋亡的影响,并在原位脑胶质瘤裸鼠模型上分析和探讨LB-100对GBM的作用。材料与方法:1.通过CCK8细胞活性实验来探究GBM细胞株U251及SHG140的生存率与LB-100药物浓度的关系,并进一步筛选出最合适的药物浓度,根据LB-100作用于两种GBM细胞24小时的半数抑制浓度（IC50）来设置实验分组,即对照组（0μM）,低浓度组（1/2IC50）,高浓度组（IC50）,培养细胞24小时后提取蛋白,并用Western Blot法检测凋亡及侵袭相关蛋白的表达情况,利用免疫荧光佐证凋亡相关蛋白的表达,并通过流式细胞术检测LB-100作用于GBM细胞后对其凋亡的影响,利用Transwell及划痕实验,在细胞层面观察LB-100药物处理后GBM细胞侵袭能力的变化。2.选取本实验室分选并培养的CD133+胶质瘤干细胞U251s及SHG140s进行CCK8细胞活性实验,探究胶质瘤干细胞生存率和LB-100药物浓度的关系,并进一步筛选出最合适的药物浓度,根据LB-100作用于两种胶质瘤干细胞24小时的半数抑制浓度（IC50）来设置实验分组,即对照组（0μM）,低浓度组（1/2IC50）,高浓度组（IC50）,培养细胞24小时后提取蛋白,并用Western Blot法检测各组CD133的表达变化以及凋亡和侵袭相关蛋白的表达情况。3.建立原位脑胶质瘤裸鼠模型并对标本进行染色处理,通过体内实验探究LB-100对GBM的作用:首先建立原位脑胶质瘤裸鼠模型（U251及SHG140）,即在裸鼠颅内接种GBM细胞株,并对实验裸鼠进行分组,共4组,每组5只,即U251对照组、U251加药组、SHG140对照组、SHG140加药组。然后培养一周（7天）后,对所有实验裸鼠进行加药处理,加药组裸鼠用配置好的LB-100药液处理,对照组用相同剂量的药物溶剂（体内药物溶剂）处理,加药方式为腹腔注射,加药剂量均为200μl,加药组裸鼠加入的药物浓度按照查阅文献所得的1.5mg/kg为标准,计算出LB-100作用于加药组裸鼠的终浓度约为447.22μM,所有裸鼠均每周给药三次,隔天给药（每周一、三、五）,共处理三周（21天）,在第21天处死实验裸鼠,动物研究按照国际公认的指导方针和国家法规进行,取出肿瘤标本并进行HE染色及免疫组化染色,观察凋亡及侵袭相关指标的变化,进一步探究在体内环境中LB-100对于GBM凋亡及侵袭能力的影响。结果:1.通过CCK8细胞活性实验我们得出:GBM细胞株U251、SHG140的生存率随LB-100药物浓度的增加而下降,其作用的IC50有所不同,LB-100作用于U251细胞的IC50约为10μM,作用于SHG140细胞的IC50约为30μM。Western Blot检测出LB-100药物处理两种GBM细胞后,凋亡相关蛋白Cleaved-Caspased3、Cleaved-PARP的表达均增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达均减少,且侵袭相关蛋白p-SRC、MMP2的表达亦减少,免疫荧光技术进一步佐证了凋亡相关蛋白的表达情况,流式细胞术检测结果显示LB-100作用于各细胞系后早期凋亡细胞的比例均有较明显的提高,Transwell和划痕实验,提示LB-100药物处理后GBM细胞侵袭能力明显下降。2.通过CCK8细胞活性实验我们得出CD133+胶质瘤干细胞株U251s、SHG140s的生存率随LB-100药物浓度的增加而下降,药物作用于各组干细胞的IC50较其相应的GBM细胞要高,LB-100作用于U251s细胞的IC50约为20μM,作用于SHG140s细胞的IC50约为60μM。Western Blot实验结果表明LB-100药物处理后,两种细胞系的CD133表达水平均下降,提示胶质瘤干细胞的干性被抑制,凋亡相关蛋白Cleaved-Caspased3、Cleaved-PARP的表达均增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达均减少,侵袭相关蛋白p-SRC、MMP2的表达也呈现降低趋势。3.我们建立了原位脑胶质瘤裸鼠模型,取出标本后,进行石蜡包埋切片,并对标本进行HE染色及免疫组化染色。我们发现LB-100处理后胶质瘤肿瘤核团较正常组更为局限,对于周围组织的侵犯明显减少,而且凋亡相关指标Cleaved-Caspased3、Bcl-2的表达发生了变化,提示GBM细胞发生了凋亡,侵袭相关指标MMP2、Snail、Vimentin的表达也发生了改变,提示GBM细胞的侵袭能力被抑制。结论:LB-100药物可以显著抑制GBM细胞株U251、SHG140以及CD133+胶质瘤干细胞株U251s、SHG140s的生长,随药物浓度的增加,细胞活性逐渐下降。LB-100可以促进GBM细胞以及CD133+胶质瘤干细胞的凋亡,并可抑制其侵袭能力。原位脑胶质瘤裸鼠模型的体内实验,在病理学上证明了 LB-100通过促进肿瘤细胞的凋亡和抑制其侵袭能力来发挥抗肿瘤作用。