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喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,主要类型为为喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC),约占95%以上。2018年,全球喉癌新发病例为177,422,占全身新发病例的1%,全球喉癌死亡病例约为94,771,约占全身肿瘤死亡病例的1%。喉癌的全球发病率在逐年上升。尽管在诊断及治疗方面已经取得了瞩目的成绩,但晚期喉癌的预后仍不容乐观。复发和转移为限制其成功治疗的主要因素。大约60%的病人在得到诊断时已经是晚期。因此,深入研究喉鳞癌远处侵袭和转移的机制尤为重要。近年来,上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤进展中的作用逐渐被认识及深入研究。EMT与肿瘤的转移和扩散密切相关,是肿瘤侵袭转移的重要机制之一。多种生长因子及细胞因子可以诱导上皮间充质转化,而TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是其中最有效的刺激因子。TGF-β是一种功能极其复杂的细胞因子,参与了多种生物学过程,如胚胎发育、组织修复和肿瘤侵袭及转移等,并调节EMT的发生发展。EMT也参与了喉癌的发生发展,如miR-203、miR-205以及LINC00339等通过EMT调控LSCC的进展,EZH2通过EMT促进LSCC的迁移和侵袭。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,不能或很少编码蛋白质的RNA分子,与肿瘤的形成、浸润和转移密切相关。我们通过表达谱基因芯片分析筛选出了转移性LSCC组织中差异表达的lncRNAs,其中microRNA-155的宿主lncRNA MIR155HG在喉癌组织中表达上调,并有相关报道显示,MIR155HG是一个间充质相关的lncRNA,说明MIR155HG有可能参与了喉癌的侵袭转移,但其在喉癌发生发展中的作用尚需进一步的研究。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约在18-25个核苷酸之间的的单链非编码RNA,主要通过与其靶mR NA分子的3’UTR(3’untranslated region,3’非编码区)碱基互补配对,实现转录后基因表达的调控,从而也参与肿瘤的发生发展。近年来,lncRNA及microRNA相互关系的研究逐渐成为学者们研究的热点,尤其是lncRNA可作为宿主基因,调控microRNA的表达,在肿瘤中发挥重要的功能。MIR155HG位于21号染色体,共由三个外显子组成,miR-155-5p位于其第三号外显子。MIR155HG作为miR-155的宿主基因,二者在淋巴瘤及神经胶质瘤中的作用已被揭示,但二者在喉鳞癌侵袭转移中的作用尚未见报道。本文旨在探讨TGF-β在LSCC细胞TU177 EMT发生中的作用,及TGF-β诱导的MIR155HG/miR-155-5p对喉鳞癌细胞恶性生物学行为及EMT进程的影响及分子机制。本课题四部分的结果汇报如下:第一部分LSCC转移相关lncRNA的筛选及TGF-β对喉鳞癌细胞EMT及MIR155HG的诱导作用目的:基于表达谱芯片技术分析筛选LSCC中差异表达的lncRNAs,并分析MIR155HG相对表达水平与LSCC患者临床病理特征的相关性,探讨TGF-β对喉鳞癌EMT及MIR155HG的诱导作用。方法:1.选取4例转移性LSCC的组织标本进行表达谱芯片检测,筛选在转移性喉鳞癌组织及癌旁正常组织中差异表达的lncRNAs。通过荧光定量反转录聚合酶链反应(transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法检测MIR155HG在LSCC组织及其相应癌旁正常组织中的表达,分析其与临床病理资料间的相关性。3.用10ng/ml的重组TGF-β处理人喉鳞癌TU177细胞系后,在倒置显微镜下观察TU177细胞形态学的变化。用Transwell实验检测经TGF-β处理的TU177迁移及侵袭能力的变化。4.qRT-PCR技术检测EMT相关标志物及MIR155HG表达水平的变化。结果:1.表达谱芯片分析技术筛选出(Fold change≥2)3073个差异表达的lncRNA,其中1967个在癌组织中表达上调,1106个在癌组织中表达下调。2.MIR155HG在45例喉鳞癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。(P<0.01)。MIR155HG的表达与LSCC患者的病理分化程度(P<0.05)、TNM临床分期及颈部淋巴结转移相关(P<0.01),与患者的年龄、饮酒及吸烟无相关性(P>0.05)。3.TU177细胞经过10ng/ml的TGF-β处理7天后,可见处理组TU177细胞逐渐变为细长梭形,纺锤形,明显地表现出间充质细胞形态。且TGF-β能显著促进TU177细胞的迁移及侵袭能力。4.TGF-β作用于TU177细胞后,间充质相关标志物N-cadherin、Twist、Snail、Vimentin及ZEB1的mR NA表达水平均显著上调,且可显著诱导MIR155HG的表达上调。第二部分lncRNA MIR155HG对喉鳞癌细胞恶性行为的影响目的:通过体内外试验,探讨MIR155HG对LSCC细胞生物学行为的影响。方法:1.应用qRT-PCR的方法检测MIR155HG在不同喉鳞癌细胞系(TU177、TU686、AMC-HN-8)中的表达。并应用在线分析软件GEPIA分析MIR155HG在头颈部鳞癌中的表达。2.应用在线软件Coding Potential Assessment Tool及ORF finder分析预测MIR155HG的蛋白编码能力。3.构建sh-MIR155HG的4个敲低质粒及pcDNA3.1-MIR155HG过表达载体,分别转染喉鳞癌细胞TU177和AMC-HN-8,并采用qRT-PCR的方法检测转染效率。选择敲低效果最好的sh-MIR155HG-1进行后续实验。分别应用MTS实验、克隆形成实验、Transwell小室实验等来检测敲低及过表达MIR155HG对喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。4.应用体内移植瘤实验检测在TU177细胞中过表达MIR155HG对裸鼠移植瘤生长的影响。5.采用qRT-PCR的方法检测在TU177细胞中敲低MIR155HG对EMT相关标志物表达的影响。结果:1.MIR155HG在LSCC细胞系中表达较高(P<0.01)。GEPIA在线分析软件结果显示MIR155HG在头颈部鳞癌组织中表达显著上调(P<0.01)。2.在线软件Coding Potential Assessment Tool及ORF finder证明MIR155HG是一个非编码RNA。3.转染sh-MIR155HG-1可有效敲低MIR155HG在喉鳞癌细胞系TU177及AMC-HN-8中的表达水平,而转染过表达载体pcDNA3.1-MIR155HG可明显上调MIR155HG在喉鳞癌细胞系TU177及AMC-HN-8中的表达水平。体外实验证实,敲低MIR155HG显著抑制TU177及AMC-HN-8的增殖、迁移及侵袭能力(P<0.01),过表达MIR155HG可显著促进TU177及AMC-HN-8的增殖、迁移及侵袭能力(P<0.01)。4.体内移植瘤实验发现,与阴性对照组小鼠相比,注射稳定转染pcDNA3.1-MIR155HG的TU177细胞可显著增加体内移植瘤的体积及重量(P<0.01)。5.qRT-PCR结果显示,在TU177细胞中敲低MIR155HG的表达可显著下调间充质相关标志物N-cadherin、Twist、Zeb1和Vimentin的mR NA表达量(P<0.01)。第三部分miR-155-5p对喉鳞癌细胞恶性行为的影响及机制目的:探讨TGF-β对miR-155-5p表达的影响,以及miR-155-5p对喉鳞癌细胞生物学行为的影响及相关分子机制。方法:1.通过qRT-PCR的方法检测TGF-β处理喉鳞癌细胞TU177后miR-155-5p表达的变化。2.应用qRT-PCR的方法检测miR-155-5p在45例喉鳞癌组织及其相应癌旁正常组织中的表达。3.分析miR-155-5p的表达与喉鳞癌患者临床病理特征的相关性。4.合成miR-155-mimic及miR-155-inhibitor,分别转染喉鳞癌细胞TU177和AMC-HN-8后,采用qRT-PCR的方法检测转染效率。分别应用MTS实验、Transwell实验来检测敲低及过表达miR-155-5p对喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。5.采用qRT-PCR的方法检测在TU177细胞中过表达miR-155-5p对EMT相关标志物表达的影响。6.运用生物信息学工具TargetScan以及miRwalk等预测miR-155-5p的靶基因,发现SOX10可能是其靶基因。应用qRT-PCR的方法检测SOX10在45例喉鳞癌组织及其相应癌旁正常组织中的表达,并分析miR-155-5p与SOX10 mR NA表达的相关性。分别应用qRT-PCR和western blot的方法检测miR-155-5p对SOX10的mR NA及蛋白表达的调控作用,并进一步应用双荧光素酶报告基因实验进一步证明二者的靶向关系。结果:1.与未处理组相比,TGF-β处理TU177后,miR-155-5p的表达显著升高(P<0.01)。2.与癌旁正常组织相比,miR-155-5p在喉鳞癌组织中表达明显上调(P<0.01)。3.miR-155-5p的表达与LSCC患者的组织分化程度(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)及淋巴结转移相关(P<0.01),与患者的年龄、饮酒及吸烟无相关性(P>0.05)。4.通过转染miR-155-mimic可有效上调miR-155-5p在喉鳞癌细胞系TU177及AMC-HN-8中的表达水平,而转染miR-155-inhibitor可明显下调miR-155-5p在喉鳞癌细胞系TU177及AMC-HN-8中的表达水平。体外实验证实,过表达miR-155-5p可显著促进TU177及AMC-HN-8细胞的增殖、迁移及侵袭能力(P<0.01),敲低miR-155-5p可显著抑制TU177及AMC-HN-8细胞的增殖、迁移及侵袭能力(P<0.01)。5.qRT-PCR结果显示,上调miR-155-5p能显著上调间充质相关标志物N-cadherin、Vimentin、Twist和Snail的mR NA表达,但不能降低ZEB1的表达。但未能检测到上皮标志物E-cadherin mR NA的表达变化。6.经生物信息学预测显示SOX10具有miR-155-5p潜在的结合位点。与癌旁正常组织相比,SOX10在喉鳞癌组织中表达明显下调(P<0.01)。qRT-PCR及western blot检测结果显示,在TU177及AMC-HN-8细胞中敲低miR-155-5p后,SOX10的mR NA及蛋白表达水平升高,过表达miR-155-5p后,SOX10的mR NA及蛋白表达水平下降。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-155-5p可以与SOX10的3’UTR区直接结合。第四部分miR-155-5p协同MIR155HG促进喉鳞癌的恶性行为及EMT进程目的:探讨miR-155-5p及MIR155HG在喉癌发生发展中的协同作用。方法:1.分析MIR155HG及miR-155-5p表达的相关性并应用qRT-PCR方法检测MIR155HG及miR-155-5p的调控关系。2.分别应用MTS实验及Transwell小室实验检测TU177及AMC-HN-8细胞中转染sh-MIR155HG-1,及共转染miR-155-mimic+sh-MIR155HG-1后对喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。3.应用qRT-PCR的方法检测TU177及AMC-HN-8细胞中转染sh-MIR155HG-1,及共转染miR-155-mimic+sh-MIR155HG-1后对EMT相关标志物表达的影响。结果:1.在TU177及AMC-HN-8细胞中敲低MIR155HG后,miR-155-5p表达显著下调(P<0.01)。过表达MIR155HG后,miR-155-5p的表达显著上调(P<0.01)。但是敲低和过表达miR-155-5p对MIR155HG的表达无明显影响(P>0.05)。2.在TU177及AMC-HN-8细胞中,共转染miR-155-mimic部分恢复了敲低MIR155HG对TU177及AMC-HN-8细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用。3.在TU177细胞中,共转染miR-155-mimic部分恢复了敲低MIR155HG对N-cadherin、Twist、Vimentin的mR NA表达的抑制作用(P<0.01)。结论:1.TGF-β能诱导喉鳞癌细胞TU177发生上皮间充质转化,并促进其迁移及侵袭。且TGF-β可诱导喉鳞癌细胞中MIR155HG及miR-155-5p的表达上调。2.MIR155HG在喉鳞癌组织及喉鳞癌细胞中表达上调,且与喉鳞癌患者的肿瘤分期、组织分化程度及淋巴结转移相关。MIR155HG促进喉鳞癌细胞的体外增殖、迁移、侵袭及EMT进程,并促进裸鼠体内肿瘤的生长。提示MIR155HG参与了喉鳞癌的进展。3.miR-155-5p在喉鳞癌组织及喉鳞癌细胞中表达上调,且与喉鳞癌患者的肿瘤分期、组织分化程度及淋巴结转移相关。miR-155-5p促进喉鳞癌细胞的体外增殖、迁移、侵袭及EMT进程,提示miR-155-5p参与了喉鳞癌的进展。4.MIR155HG调控miR-155-5p的表达,通过靶向miR-155-5p/SOX10轴,促进喉鳞癌细胞的体外增殖、迁移及侵袭。5.MIR155HG和miR-155-5p协同促进喉鳞癌细胞的恶性行为及EMT进程。