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目的:探索HepG2细胞发生上皮间质转化(EMT)对索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药及联合敏感性的影响及其作用机制,为临床应用中药逆转肝癌靶向药物耐药提供理论依据。方法:(1)采用TGFβ1诱导人肝癌细胞株HepG2发生EMT,建立HepG2/EMT细胞;观察该过程中细胞形态的改变,并检测上皮细胞标志蛋白和间质细胞标志蛋白的表达情况。(2)用MTT法检测索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药及联合对两种细胞增殖的影响;分别检测HepG2细胞和HepG2/EMT细胞对索拉非尼联合不同浓度20(S)-人参皂苷Rg3的敏感性。流式细胞术检测索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药及两药联合对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞的周期阻滞和诱导凋亡作用。Western blotting法检测索拉非尼和20(S)-人参皂苷Rg3对EMT相关细胞信号转导通路Ras/Raf/MEK/ERK通路蛋白的影响。结果:1.TGFβ1能够诱导HepG2细胞发生EMT,在此过程中随着培养时间的延长(Oh、24h、48h、72h)上皮细胞标志蛋白表达降低、间质细胞标志蛋白表达上升(P<0.01,P<0.01);细胞形态也发生变化,"触角"明显变长。2.MTT结果显示:索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药及联合对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞具有增殖抑制作用,且呈现显著的时效量效关系,联合组强于单药组(P<0.05)。索拉非尼低浓度组对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞抑制率差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05)。不同浓度20(S)-人参皂苷Rg3对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞抑制率差异无规律性。索拉非尼分别与三个不同浓度20(S)-人参皂苷Rg3组联合在HepG2细胞中表现为协同作用,在HepG2/EMT细胞中表现为相加作用,联合后较单药后抑制作用增强(P<0.01)。索拉非尼分别与三个不同浓度20(S)-人参皂苷Rg3联合对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞抑制率差异有统计学意义(P<0.O1,’＜0.O1,P＜0.01),随着20(S)-人参皂苷Rg3联合浓度的升高对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞的抑制率增强(P＜0.01,’＜0.0I,’＜0.01)。联合浓度组均对HepG2/EMT细胞抑制作用减弱(P＜0.OI,P＜0.OI,P＜0.0I)。3.流式细胞术结果:TGFβ1诱导人肝癌细胞株HepG2发生EMT前后细胞周期均在G1期。索拉非尼、两药联合将HepG2细胞和HepG2/EMT细胞阻滞在G1期;20(S)-人参皂苷Rg3将HepG2细胞阻滞在G1期,将HepG2/EMT细胞阻滞在S期。HepG2发生EMT后自然凋亡率降低。索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药诱导HepG2细胞和HepG2细胞的凋亡率低于两药联合(P<0.01);HepG2/EMT细胞中,索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3诱导凋亡率降低(P<0.01,P<0.01),两药联合诱导细胞凋亡率升高(P<0.01)。4.Western blotting结果:索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药及联合对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路蛋白表达的抑制作用具有统计学意义(P<0.05)。HepG2 细胞发生 EMT 后,Ras、Raf、pMEK、pERK1/2 蛋白上调(P<0.05);MEK、ERK1/2蛋白表达下调(P<0.05)。索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3能够抑制HepG2细胞和HepG2/EMT细胞中Ras、Raf、pMEK、pERK1/2蛋白表达,索拉非尼较20(S)-人参皂苷Rg3抑制作用强(P＜0.05),联合后抑制作用较单药增强(P＜0.055,P＜0.05)。索拉非尼、20(S)-人参皂苷Rg3单药及联合对HepG2/EMT细胞中Ras、Raf、pMEK、pERK1/2蛋白表达抑制作用减弱(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05)。HepG2/EMT细胞中两药联合组MEK蛋白表达较索拉非尼单药组降低(P＜0.05),与20(S)-人参皂苷Rg3单药组差异无统计学意义(P>0.05)。两药联合组ERK1/2蛋白表达较20(S)-人参皂苷Rg3单药组低(P<0.05),与索拉非尼单药组之间无统计学差异(P>0.05)。结论:1.索拉非尼对HepG2细胞和HepG2/EMT细胞均具有增殖抑制作用。HepG2细胞发生EMT后,对索拉非尼敏感性降低。与20(S)-人参皂苷Rg3联合后抑制作用明显增强,20(S)-人参皂苷Rg3可以提高HepG2/EMT细胞对索拉非尼的敏感性。2.索拉非尼对HepG2/EMT细胞诱导凋亡作用减弱,当与联合20(S)-人参皂苷Rg3后,诱导凋亡的作用明显增强,表明20(S)-人参皂苷Rg3能够促进索拉非尼诱导细胞凋亡,提高HepG2/EMT细胞对索拉非尼敏感性。3.索拉非尼能抑制HepG2细胞和HepG2/EMT细胞Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白的表达,但对前者作用强于后者,这与HepG2细胞.发生EMT后Ras/Raf/MEK/ERK信号通路异常活化有关。当索拉非尼联合20(S)-人参皂苷Rg3后其抑制作用强于索拉非尼单药,说明20(S)-人参皂苷Rg3能提高HepG2/EMT细胞对索拉非尼敏感性,可能与调节Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。