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研究背景：大肠癌(Colorectal cancer)是严重威胁人类生存的消化系统恶性肿瘤之一,在西方国家恶性肿瘤的发病率中居第二位。我国百姓随着生活水平提高,饮食习惯发生高脂肪,高蛋白,低纤维,低粗粮等结构性改变,使得中国大肠癌出现高发态势,总体发病率也呈上升趋势,已居我国常见恶性肿瘤第四位。在临床上,大肠癌侵袭和/或转移的发生是导致患者死亡的重要原因,根据WHO的统计,被诊断为大肠癌早期阶段的患者其五年生存率为百分之九十,然而,一旦大肠癌发展至邻近器官或淋巴结,其五年生存率将大大降低。仅有百分之三十九的患者被发现处于大肠癌的早期阶段,因此,阐明大肠癌侵袭转移的分子机制是十分重要的。肽基脯氨酰同分异构酶(peptidy-prolyl cis/trans isomerase PPIase,简称Pin1)是一种高度保守、特异的多肽脯氨酰基顺反异构酶(PPIase),可特异性地催化磷酸化的脯氨酰前的丝氨酸或苏氨酸位点(serine or threonine residues preceding proline,简称Ser/Thr-Pro基序),使其发生顺反异构,从而改变底物蛋白的构像,调节蛋白质的功能。Pin1在人类多种恶性肿瘤中起着调节肿瘤的发生发展的重要作用,被称为肿瘤发生、发展的催化分子,与肿瘤的增殖失控、血管形成、恶性侵袭有关。研究发现,Pin1在结直肠癌中过表达,并与结直肠癌进展明显相关。本研究应用RNA干扰技术进一步探讨Pin1对结肠癌侵袭转移能力影响及作用机制。目的：1.构建针对Pin1基因的RNA干扰真核表达载体(pGenesil-1-PIN1,简写p-shRNA)。2.观察pGenesil-1-PIN1对大肠癌SW480和SW620细胞中Pin1基因的表达的抑制作用。3.探讨Pin1基因沉默后对大肠癌SW480和SW620细胞侵袭转移的影响,初步分析其发挥作用的可能分子机制。方法：1.合成针对Pin1基因的短发夹结构真核表达载体pGenesil-1-PIN1与其对照载体pGenesil-1-CON(简写p-CON)经双酶切琼脂糖凝胶电泳及DNA测序鉴定正确。2.在脂质体介导下将真核表达质粒p-shRNA和p-CON分别转染人大肠癌细胞株SW480和SW620,,提取总蛋白质,应用Western blot技术检测其对Pin1蛋白质表达水平的影响。3.利用细胞划痕实验检测SW480和SW620细胞转染p-shRNA质粒或p-CON质粒后的迁移能力,采用Boyden chamber实验检测SW480和SW620细胞转染后的侵袭转移能力。4.用明胶酶谱法检测SW480和SW620细胞转染p-shRNA质粒或p-CON质粒后表达MMP-2及MMP-9蛋白活性的变化。5.凝胶迁移率变动分析(EMSA)检测在Pin1干扰后NF-κB活性的变化,以及检测Pin1干扰后SW480和SW620细胞核蛋白与MMP-9-NF-κB寡核苷酸探针的结合情况。结果：1.成功构建针对Pin1基因的RNA干扰真核表达载体。2.转染SW480细胞后,SW480/p-shRNA(干扰组)中Pin1蛋白表达的灰度值为(0.49±0.07), SW480/p-CON(对照组)中为(0.94±0.09),SW480(未处理组)中为(1.01±0.11)(P<0.05)。转染SW620细胞后,SW620/p-shRNA组中Pin1蛋白表达的灰度值为(0.44±0.11), SW620/p-CON组中为(0.98±0.10),SW620组中为(0.99±0.09)。转染pGenesil-1-PIN1后,可以抑制SW480和SW620细胞中Pin1蛋白的表达3.转染SW480细胞后,SW480/p-shRNA组中MMP-2和MMP-9蛋白表达的灰度值分别为(0.39±0.08)和(0.45±0.07), SW480/p-CON组中分别为(0.82±0.07)和(0.83±0.07),SW480组中分别为(0.84±0.07)和(0.93±0.05)。转染SW620细胞后,SW620/p-shRNA组中MMP-2和MMP-9蛋白表达的灰度值分别为(0.32±0.04)和(0.41±0.09), SW620/p-CON组中分别为(0.76±0.03)和(0.94±0.07),SW620组中分别为(0.76±0.01)和(0.95±0.05(P<0.05)。转染pGenesil-1-PIN1后,可以抑制SW480和SW620细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达4.抑制肿瘤侵袭转移的研究发现,SW480和SW620细胞转染pGenesil-1-PIN1后体外侵袭转移能力下降：划痕擦伤后实验组细胞平面迁移能力明显降低；Boyden chamber实验显示,SW480/p-shRNA组约有(49.6±7.2)个细胞穿过了聚碳酸酯膜,SW480/p-CON组约(90.2±6.5)个细胞；SW620/p-shRNA组约(52.7±4.4)个细胞,SW620/p-CON组约(96.4±3.9)个细胞穿过了聚碳酸酯膜(P<0.05, Student’s t-test)。5. EMSA结果显示,SW480和SW620细胞中的核蛋白可与NF-κB寡核苷酸探针发生特异性结合；转染pGenesil-1-PIN1后,SW480和SW620细胞核蛋白与MMP-9-NF-κB寡核苷酸探针结合水平明显下降。结论：成功构建针对Pin1基因的RNA干扰质粒,可以有效抑制人大肠癌SW480和SW620细胞体外恶性增殖及迁移能力。其作用机制与Pin1基因沉默后降低NF-κB转录活性进而下调MMP-2与MMP-9基因的表达和生物活性有关,为大肠癌基因治疗提供新的思路和方法。