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柑橘在生长发育的过程中易受到各种逆境胁迫,因此会对柑橘产业产生影响。为解决这些问题必须加强培育抗性强的柑橘品种。传统的育种手段对于果树育种来说,需要的周期长,局限性较大,而随着基因工程技术的应用,将一些具有抗性的基因转入柑橘中将加快柑橘育种的进程。枳(Poncirus trifoliata)是柑橘中广泛应用的砧木之一,具有较强的抗寒性。已有研究表明,ABF和CDPK能被逆境诱导表达,参与逆境响应调控。本研究利用超表达Ptr ABF和Ptr CDPK早实枳,进一步分析了它们的基因功能及其作用机理,研究结果如下:1、对Ptr ABF基因转早实枳株系进行PCR鉴定,获得6株阳性转基因植株。Ptr ABF基因在#8和#10株系中超量表达。试验结果显示,转基因株系较野生型有较强的抗脱水能力。扫描电镜观测显示转基因植株的气孔密度和开度较野生型降低。RT-PCR显示气孔发育相关基因SPCH、FAMA和MUTE在转基因株系中表达量下降。Ptr ICE1是气孔发育的关键基因,利用酵母双杂交和Bi FC技术表明Ptr ABF能与Ptr ICE1互作。对正常条件下的野生型和#10系进行基因芯片杂交,共挑选出70个差异表达基因,其中上调表达42个,下调表达28个。随机挑选了10个上调表达基因进行了RT-PCR验证与芯片结果一致。在上调表达的42个差异基因中,33个差异基因有功能注释。并分析了33个上调表达的差异基因的启动子中的ABREs(ABA-responsive elements)和CEs(coupling elements)顺式作用元件。33个上调表达的差异基因中,大部分启动子中仅包括ABREs、CEs或二者的组合式顺式作用元件,只有5个不含有ABREs或CEs顺式作用元件。基因芯片分析显示,Pt POD和Pt ADC的转录水平在转基因系(#10和#8)中表达高于野生型(WT)。酵母单杂交和瞬时表达进一步验证了Ptr ABF能与Pt ADC和Pt POD启动子互作。转基因系中POD酶活性在脱水处理前后是野生型的大约2倍,脱水处理后,在转基因株系中POD、CAT、SOD酶活性均高于野生型,此结果与其基因表达量一致。ROS结果显示转基因叶片中H2O2和O2-的含量均显著低于野生型,与DAB和NBT的染色结果一致。此外,转基因系中MDA含量显著低于野生型,与较低ROS积累结果一致。正常生长条件下的转基因系中的自由态多胺(腐胺、精胺、亚精胺)均高于野生型。不同浓度的D-arg(ADC抑制剂)预处理转基因株系,脱水处理后,转基因株系中H2O2和O2-的积累和含量随着D-arg浓度的增加而增加。不同浓度的双胍辛胺乙酸盐预处理后再进行脱水处理,结果显示,随着双胍辛胺乙酸盐浓度的增加,转基因系中H2O2的积累较野生型少,且转基因株系中抗氧化物酶的基因表达和酶活性也比野生型降低。2、Ptr CDPK编码一类丝氨酸/苏氨酸激酶,开放读码框含有1676bp碱基,编码558个氨基酸,该蛋白的分子量为63.25 k Da,等电点为8.26。Ptr CDPK的催化区含有1个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结合区和调控区含有4个EF手型结构钙结合区,氨基酸比对显示与其他物种的相似性较高。与拟南芥CDPK家族进行进化树分析显示Ptr CDPK被划分为第III族成员。Ptr CDPK能响应多种胁迫如ABA、干旱、盐等,并定位于细胞核和细胞膜上。对Ptr CDPK基因转早实枳株系进行PCR鉴定,获得4株阳性转基因植株。Ptr CDPK基因在#34和#36株系中超量表达。转基因植物具有较强的抗脱水能力,转基因植物的相对失水率、电导率、MDA含量均低于野生型。转基因株系积累较少的ROS,且测定的抗氧化酶的活性及其酶的基因表达量均高于野生型。生物信息学分析发现SOD、POD和CAT基因中含有多个CDPK可磷酸化位点,包括Ser、Thr、Try。综上所述,Ptr CDPK可能通过磷酸化抗氧化酶的方式提高ROS的清除提高转基因株系的抗脱水能力。