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金属元素镉是分布广泛的环境污染物。镉经消化道或呼吸道进入机体后,在多个器官中蓄积,并引起急性或慢性损伤。肝脏是镉蓄积和损伤的重要靶器官之一,近些年研究发现,镉能够诱导肝细胞自噬,并且适当的自噬是细胞抵抗镉毒性损伤的保护机制。葛根素是中草药葛根中的主要化学成分,具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等多种功效。研究发现,葛根素能够诱导细胞自噬,减轻镉引起的细胞损伤,但其具体机制尚不明确。本试验以小鼠正常肝细胞系AML12细胞为研究对象,通过氯化镉与葛根素单独或联合处理细胞,利用细胞分子生物学相关方法,探究镉暴露对肝细胞自噬与溶酶体功能的影响及葛根素的保护效应,为进一步揭示镉的毒性机制以及镉中毒防治提供理论依据。1.葛根素对镉致AML12细胞损伤的保护效应为了探讨葛根素在镉致AML12细胞损伤中的作用,本研究通过镉与葛根素单独或联合处理细胞,用xCELLigence细胞实时分析系统(Real-time cell analysis,RTCA)检测细胞指数(Cell index,CI),倒置荧光显微镜观察细胞形态,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态,透射电子显微镜观察细胞超微结构。结果表明,镉暴露引起AML12细胞损伤,主要表现为抑制CI上升速度;引起细胞形态与细胞核形态改变;破坏细胞超微结构。葛根素能够缓解镉引起的上述损伤。2.镉对AML12细胞自噬的影响及葛根素的保护效应为了探究自噬在镉致AML12细胞损伤中的作用,以及葛根素的保护作用。本试验以5 μM镉与200μM葛根素单独或联合处理细胞12 h,透射电子显微镜观察自噬小体变化,MDC荧光染色观察自噬水平变化,免疫荧光法观察LC3聚点变化;5μM镉处理细胞不同时间(0、3、6、12、24 h)、不同浓度镉(0、2.5、5、10μM)处理细胞12 h,免疫印迹法检测自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1、LC3Ⅱ、P62的表达水平;5 μM镉分别与50 nM Bafilomycin A1(Baf)、200μM葛根素单独或联合处理细胞12h,免疫印迹法检测细胞自噬流变化;5μM镉分别与50 nM Baf、50 nM RAPA单独或联合处理细胞,RTCA监测CI变化。结果表明,镉诱导AML12细胞自噬水平升高,且在5 μM镉处理细胞12 h时,自噬水平最高(P<0.01);镉暴露引起细胞自噬流阻滞,自噬流阻滞加剧了镉对细胞的毒性损伤;葛根素可诱导细胞发生自噬,缓解镉引起的自噬流阻滞,进而对镉引起的细胞损伤具有一定的保护效应。3.镉对AML12细胞溶酶体功能的影响及葛根素的保护效应为了探讨镉致AML12细胞自噬流阻滞的可能机制,以及葛根素的保护效应,本试验以5μM镉处理细胞不同时间(0、3、6、12、24 h)、不同浓度镉(0、2.5、5、10、20 μM)处理细胞12 h、5 μM镉与200 μM葛根素单独或联合处理细胞12 h,通过Lyso-Tracker Red(LTR)荧光染色,观察细胞溶酶体酸性环境的变化;免疫印迹法检测溶酶体相关膜蛋白2(Lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、组织蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)以及Rab7的表达。5 μM镉与200 μM葛根素单独或联合处理细胞12 h、Baf处理细胞12 h、EBSS处理细胞12 h,通过DQ-BSA-Green降解实验,检测溶酶体降解功能。50 nM RAPA单独处理细胞 12 h、5 μM 镉分别与 200 μM 葛根素、50 nM Thapsigargin(TG)、50 nM Baf单独或联合处理细胞12 h,免疫荧光法观察LAMP2与LC3共定位情况。结果表明,镉暴露引起AML12细胞溶酶体活化,主要表现为溶酶体酸化、LAMP2与CTSB的表达增加;镉促进溶酶体降解功能但导致LAMP2与LC3共定位减少;此外,镉抑制Rab7的表达,且呈时间-剂量效应关系;葛根素与镉共处理可进一步促进溶酶体活化,有效恢复LAMP2与LC3共定位并增加Rab7的表达。综上所述,镉暴露引起AML12细胞损伤,并促进细胞自噬,同时引起自噬流阻滞,自噬流阻滞进一步加剧镉暴露对细胞的毒性损伤;镉诱导AML12细胞溶酶体活化,促进溶酶体降解功能,抑制溶酶体与自噬体融合;此外,镉抑制调控溶酶体与自噬体融合的关键调节蛋白Rap7的表达;葛根素可促进AML12细胞自噬,可缓解镉引起的细胞损伤,其内在机制可能与葛根素恢复自噬体与溶酶体融合,恢复Rab7的表达,进而缓解镉引起的自噬流阻滞有关。