论文部分内容阅读
目的：DNA甲基化和组蛋白乙酰化是表遗传学调控基因表达的重要机制，二者在肿瘤发生、发展和转归的过程具有重要作用．DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza-C)通过对DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的抑制逆转甲基化介导的表遗传学异常，起到对肿瘤细胞生长抑制和诱导分化作用．组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate,SPB)通过对组蛋白去乙酰化酶(histone seacetylase,HDAC)的抑制而达到对肿瘤细胞的生长抑制、诱导分化及诱导凋亡的作用。本试验的目的是：(1)比较单独和联合用药应用5-aza-C和SPB的体外生长抑制及致凋亡作用；(2)评价5-aza-C和SPB的抗肿瘤增效作用；(3)比较单独及联合应用5-aza-C和SPB对DNMT1、DNMT3a和HDAC表达的影响；(4)应用基因芯片的方法评价5-aza-C和SPB单独和联合应用时重新激活被沉默的基因的能力。 方法：(1)在体外培养人大肠癌细胞LoVo，用光镜、电镜、流式细胞术及DNA片段化分析观察单独或联合应用5-aza-C和SPB对LoVo细胞的生长抑制及诱导凋亡作用；(2)将5-aza-C和SPB二者联用或和胸苷合成酶(Thymidylate synthase,TS)抑制剂洛拉曲克联用观察5-aza-C和SPB的抗肿瘤增效作用；(3)提取空白及处理组的总RNA，用RT-PCR的方法比较单独及联合应用5-aza-C和SPB对DNMT1、DNMT3a和HDAC三者mRNA表达的影响；(4)提取空白及处理组的总RNA，经质量检测，用联合基因公司人类基因组分类Ⅰ芯片(BioStarH-I)检测被5-aza-C和SPB单独和联合应用重新激活的基因。 结果：(1)光镜观察到5-aza-C和SPB单用及联用均具有生长抑制、诱导DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白脱乙酞化酶抑制剂的抗肿瘤研究分化及凋亡作用;电镜和DNA片段化分析在5一aza一C组及联用组发现核改变及DNA的片段化，但SPB组没有观察到;流式细胞术观察到5一aza一C和SPB单用及联用均具有生长抑制及诱导凋亡作用.(2)5一aza-C和SPB联用在Lovo及人肝癌细胞HeP3B均取得了明显的增效作用;5一aza一C或sPB与洛拉曲克联用时在Lovo细胞的效果好于HeP3B细胞，且大多取得了良好的增效作用.(3) RT一PcR结果与空白组相比，5一aza一c组使DNMTI、DNMT3a和HDAC三者1五RNA分别减少了59.3%、38.6%和7.4o/o;sPB组使三者分别减少了7.6%、4.6%和60.3%;联合组效果明显，三者分别减少了78.9%、75.0%和84.4%.(4)经过Bios柱叮H一I芯片检测，5一aza一C组下调了4个基因的表达，同时上调了14个基因;SPB组下调了2个基因的表达，同时上调了14个基因;联合组下调了12个基因的表达，同时上调了46个基因的表达.结论:(1)甲基化抑制剂5一aza一C和脱乙酞化抑制剂SPB均有良好的肿 瘤细胞生长抑制及凋亡诱导作用. (2)5一aza一C和SPB均显示了良好的抗肿瘤增效作用，提示针对 DNMT和HDAC的抑制剂可能在临床与其他化疗药物的联合 应用及克服MDR有很好的前景. (3)肿瘤细胞通过异常的甲基化和脱乙酞化确实抑制了和肿瘤细 胞负性生长相关的众多基因，5一aza一C和SPB可以通过对 DNMT和HDAC的调节逆转肿瘤细胞的表遗传紊乱. (4)联合应用甲基化抑制剂和脱乙酞化酶抑制剂对于逆转肿瘤的 表遗传学紊乱可以明显增强二者单用的效果，提示甲基化和 脱乙酞化在肿瘤中的作用可能是偶联的. 上述试验表明，甲基化抑制剂和脱乙酞化酶抑制剂可以通过对中文摘要DNMT和HDAC的抑制，重新打开这些由于异常表遗传学而沉默的基因，逆转由于肿瘤组织表遗传学紊乱而介导的生物学效应，表遗传学的基因“开关”作用可能在肿瘤的发生、发展及预后中具有重要地位.