目的：抑郁症是一种常见的精神疾病,表现为一种持久的抑郁状态,并伴有意志消沉、思维迟钝、言语减少、睡眠障碍和自杀倾向等症状。抑郁症迄今已成为全球性的主要精神卫生问题,终身患病率达15～17%。目前的抗抑郁药物主要是合成药,常用的传统抗抑郁药物有单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRIs)、选择性NA再摄取抑制剂(SNRIs)和三环类抗抑郁剂(TCA)。当前大部分抗抑郁药物只能缓解部分症状,副作用较多且伴随起效延迟的特点。越来越多的科研工作者将眼光投向开发新型、高效、低毒副作用的天然抗抑郁药物。近年来,对中药小补心汤黄酮类提取物、槟榔坚果、半夏厚朴汤、预知子提取物(Fructus Akebiae extract, FAE)等研究发现天然药物具有一定的抗抑郁作用。《本草纲目》记载预知子是治疗心理疾病、认知行为缺陷,包括失眠、失忆、语言错乱、恐怖、抑郁等复杂症候的主要处方成分。此外,有文献报道FAE具有抗抑郁活性,其主要成分是常春藤皂苷元(Hederagenin, HG)。我们实验室前期的研究已经证实了FAE具有抗抑郁作用,与其增强5-HT、DA神经系统作用有关,其中FAE的主要成分HG纯度大约70%。在已有研究证实FAE具有抗抑郁作用的基础上,本课题通过建立细胞和多种动物抑郁模型,对FAE主要成分HG的抗抑郁药效进行分析评价,并且进一步在出生8～21d的大鼠中注射氯丙咪嗪(Clomipramine, CL)作为内源性抑郁模型,利用大鼠慢性温和性不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS)作为外源性抑郁模型的基础上,采用免疫组化(Immunohistochemical, IHC)测定CL模型各组大鼠海马BDNF表达变化,运用高效液相-电化学方法(HPLC-ECD)测定HG对CUMS大鼠海马、皮层区域单胺类神经递质的变化以及实时荧光定量PCR (Real-time PCR)检测HG对CUMS大鼠海马、皮层BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的影响以初步明确HG可能的药理作用机制,为开发新型、高效、低毒副作用的天然抗抑郁药物奠定理论基础和提供实验依据。方法：连续灌胃给药14d后进行高架十字迷宫(Elevated plus maze, EPM)以及21d后进行悬尾实验(Tail suspension test, TST)和强迫游泳实验(Forced swimming test, FST)比较FAE (50mg·kg-1)和HG (20mg·kg-1)的抗抑郁活性以初步确定是否是HG发挥主要的抗抑郁作用。在此基础上,体外培养PC12细胞,以皮质酮(Cort)诱导PC12细胞损伤建立细胞模型后进行四甲基偶氮唑蓝(Methyl Thiazollyl Tetrazolium, MTT)法观察不同浓度HG(4、8、16μmo1·L-1)对PC12细胞活力和形态的影响；另外,体内单次给药以及连续给药14d后,分别通过TST和FST对不同剂量HG (10、20、40mg·kg-1)进行抗抑郁活性的药效学初筛,并考察HG是否影响小鼠的自主活动；试剂盒测定HG对小鼠海马超氧化物岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响；进一步建立内源性新生大鼠抑郁模型和外源性CUMS抑郁模型。依据行为学结果评价两种抑郁模型,抑郁模型成功建立后分为正常对照组(Veh)、模型组(CUMS+Veh或CL+Veh)、阳性对照组(ESC,5mg·kg-1)和HG处理组(5mg·kg-1)并连续灌胃给药28d,分别进行旷场实验(Open field test, OFT)、EPM和FST评价HG对内-外源性大鼠抑郁模型的抗抑郁效果。IHC检测HG对CL模型大鼠海马BDNF表达的影响；此外,运用HPLC-ECD测定HG对CUMS模型大鼠的海马、皮层区域单胺类神经递质(NA,5-HT)的变化以及RT-PCR检测BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的表达情况。结果：1、利用小鼠行为绝望模型比较FAE和HG的抗抑郁活性在行为学EPM、TST和FST测试中发现,分别给予50mg·kg-1FAE和20mg·kg-1HG后,在第14天的EPM中,与Veh组相比,FAE和HG并没有显著增加开臂滞留时间百分比；而在给药21d后的TST和FST中,与Veh组相比,HG能显著降低小鼠悬尾和强迫游泳的不动时间,FAE则无显著变化,不具有统计学差异。2、HG抗抑郁作用药效的初步确定采用Cort诱导PC12细胞损伤建立细胞模型,MTT实验结果显示：Cort损伤后细胞活力显著下降,HG处理组(4、8μmol·L-1)能显著提高细胞活力,而HG在16μmo1·L-1没有显著改善细胞的受损程度。在倒置显微镜下可观察到正常的PC12细胞贴壁生长,呈梭形或纤维状,形态清晰,结构完整。经Cort损伤后,细胞皱缩呈圆形,处于悬浮状态,细胞碎片较多。ESC、HG4和8μmol·L-1给药处理的PC12细胞损伤程度较轻,形态清晰,结构完整,贴壁生长的细胞明显增多。而HG16μmol·L-1在一定程度上改善细胞的受损程度,细胞碎片较少。小鼠TST和FST结果显示：急性单次给药后,与Veh组相比,HG低剂量(10mg·kg-1)明显缩短小鼠悬尾不动时间。连续灌胃给药14d后,TST和FST结果显示：与Veh组相比,HG在不影响小鼠自主活动能力的前提下降低小鼠悬尾和强迫游泳的不动时间,其中低剂量具有显著性差异。试剂盒检测结果显示：与Veh组相比,HG能提高小鼠海马中的SOD活性,并显著降低MDA含量。3、内源性CL大鼠抑郁模型实验HG对CL大鼠体重变化的影响采用重复测量设计资料的方差分析法进行统计分析,各组大鼠断奶后每周称重,给药前各组体重呈逐步增加的趋势；给药后,Veh组、5mg·kg-1CL+ESC组和5mg·kg-1CL+HG组均比CL+Veh组表现出相对较高的体重增加,但各组之间无显著性差异。给药治疗28d后,OFT结果显示：与Veh组相比,CL+Veh组水平得分具有降低的趋势,而ESC和HG具有提高水平得分低的趋势：各组在垂直得分水平上均无明显变化,不具有统计学差异。在EPM中,与Veh组比较,CL+Veh大鼠进入开臂滞留时间百分比显著降低,给予ESC和HG治疗后具有升高开臂滞留时间百分比的趋势,但没有显著性差异。在FST中,与Veh组比较,CL+Veh组大鼠的不动时间显著升高,而给予HG治疗后能显著降低大鼠的不动时间。此外,从免疫组化图像中可观察到与Veh组相比,CL+Veh模型组海马BDNF阳性细胞数量明显减少；与CL+Veh模型组相比,CL+ESC、CL+HG组海马BDNF表达阳性细胞数量明显增加。4、外源性CUMS大鼠抑郁模型实验HG对CUMS大鼠体重变化的影响采用重复测量设计资料的方差分析法进行统计分析,从实验开始后每周称重,第5周开始,与Veh组相比,CUMS+Veh组大鼠体重显著下降；给药后,与Veh组比较,CUMS+Veh、CUMS+ESC、 CUMS+HG各组体重均下降,有统计学差异。行为学评价造模成功后分组,分别在给药治疗14、28d后进行OFT,给药14d的OFT结果显示：各组在水平和垂直得分没有明显差异,慢性给药28d后,5mg·kg-1HG具有提高水平得分和垂直得分的趋势。在EPM中,给药28d后,与CUMS+Veh组比较,CUMS+HG组大鼠进入开臂滞留时间百分比显著升高,具有显著性差异。在FST中,与Veh组比较,CUMS+Veh组大鼠的不动时间显著升高,而慢性给予ESC和HG能显著降低大鼠的不动时间,具有统计学差异。行为学结束后分别对CUMS模型大鼠海马、皮层区域单胺类神经递质和BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的表达情况进行检测。HPLC-ECD结果显示：CUMS组海马去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)水平显著下降,ESC和HG均能逆转CUMS造成NA、5-HT水平的降低,显著升高NA、5-HT水平；而在皮层中,ESC和HG具有显著升高NA水平,同时升高5-HT水平的趋势,但没有统计学差异。RT-PCR结果显示：与Veh组比较,CUMS+Veh组海马区域的BDNF mRNA降低,与CUMS+Veh组比较,CUMS+ESC和CUMS+HG组没有明显变化；与Veh组比较,CUMS+Veh组5-HT1A mRNA降低,而HG具有提高5-HT1A mRNA水平的趋势,但不具有统计学差异；CUMS+Veh组5-HTTmRNA明显升高,慢性给予ESC和HG能使之逆转,5-HTT mRNA水平显著下降。而在皮层中,各组之间的BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA表达均无明显差异。结论：从以上结果可推测HG较FAE具有更好的抗抑郁活性,HG在体内和体外抑郁模型中具有抗抑郁活性,其对调节机体氧化-抗氧化酶活性、降低过氧化损伤,保护海马免受氧化应激损伤起到一定的改善作用。此外,HG对内-外源性抑郁模型动物的焦虑/抑郁样行为有一定的改善作用,这可能是通过调节5-HT神经系统,升高NA、5-HT水平,显著降低5-HTT mRNA水平发挥抗抑郁作用。综上所述,本课题证明了FAE的主要成分HG具有良好的抗抑郁药效作用,初步揭示了其可能的抗抑郁机制,提示HG具有作为抗抑郁天然药物单体成分开发的价值。