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目的:神经病理性疼痛（neuropathic pain,NP）是慢性疼痛的一种,严重影响患者生活质量,其病因多种多样,如神经损伤、带状疱疹后遗神经痛、脑卒中、艾滋病、缺血性疾病。神经病理性疼痛的疼痛机制主要是外周敏化以及中枢敏化,临床表现主要为痛觉过敏、痛觉超敏以及自发痛。神经病理性疼痛其疾病本身不仅使患者出现痛觉超敏、痛觉过敏,而且还会产生疼痛共病,负性情绪等临床表现。研究人员通过应用经典的神经病理性疼痛动物模型模拟其临床表现,逐渐解释了神经病理性疼痛的机制。通过应用神经病理性疼痛模型,团队的前期实验验证了在神经病理性疼痛中脊髓自噬水平受阻,并且激活脊髓自噬可以缓解神经病理性疼痛。自噬可以有效降解机体无法利用的蛋白和细胞器,从而促进细胞生存,并且提供更好的细胞状态以及生物功能。自噬分为巨自噬、小自噬、分子伴侣介导自噬。巨自噬是自噬前体与被降解的成分结合,闭合形成自噬小体,进而自噬小体与溶酶体结合形成自噬小体溶酶体,使得吞噬的内容物降解,通过这一过程,自噬方便机体更好利用原料。选择性自噬是选择性吞噬降解某一种特定类型内容物。相应的,当巨自噬吞噬的内容物是内质网时,称为内质网自噬（ER-phagy）。内质网是合成蛋白质主要细胞器,在钙超载、错误折叠蛋白或者未折叠蛋白反应等条件下可以造成内质网应激（ER stress,endoplasmic reticulum stress）,内质网应激可以进一步激活未折叠蛋白反应PERK（protein kinase RNA-like ER kinase,蛋白激酶RNA样内质网激酶）,IRE1（inositol-requiring enzyme 1,肌醇酶1）和ATF6（activating transcription factor 6,活化转录因子6抗原）三条通路的激活。论文第一部分首先探讨在神经病理性疼痛脊神经结扎（SNL,spinal nerve ligation）模型中,内质网应激与内质网自噬的相互关系。STING（stimulator of interferon genes,干扰素刺激基因）是内质网上锚定蛋白,有穿膜结构。机体通过c GAS（cyclic GMP-AMP synthase,环化鸟苷酸腺苷酸合酶）激活下游信使2’3’c GAMP和3’3’c GAMP,进而激活STING,使得STING磷酸化水平增加,磷酸化的STING可以提高下游IRF（interferon regulatory factor,干扰素调节因子）的磷酸化水平,继而激活Bcl-x L抑制线粒体外膜透化作用,导致细胞凋亡。在中枢神经疾病中,激活STING可起到刺激炎症反应的作用,是神经炎性反应的重要调节靶点,然而在神经病理性疼痛中,STING在脊髓的细胞类型定位,以及改变STING通路活性是否引起内质网自噬水平的改变有待研究,本论文将探讨STING通路是否参与神经病理性疼痛,以及STING通路在神经病理性疼痛中的变化。如上所述,神经病理性疼痛不仅在分子水平、解剖水平改变疼痛传导通路,而且使患者产生负性情绪共病,严重影响患者社会功能以及生活质量。随着疼痛微创介入手术的开展,从神经毁损、神经阻滞到神经调控,临床医师不断通过应用微创介入技术手段提供缓解慢性疼痛的良方。脊髓电刺激作为一种神经调控的方式在临床上有很好的疗效。投入临床应用半个世纪以来,脊髓电刺激对于腰椎手术失败综合征（Failed Back Surgery Syndrome,FBSS）,慢性复杂区域疼痛综合征（Chronic Regional Pain Syndrome,CRPS）,神经病理性疼痛,顽固性心绞痛,难治性会阴痛,外周血管疾病导致的疼痛等一系列疾病都有明显治疗作用。在安全性方面,由于脊髓电刺激是植入电极,电极可以随时拆除,并且电刺激参数可随时调整,所以脊髓电刺激安全性较高,正因如此也有孕妇安装脊髓电刺激的报道。在脊髓电刺激的经典机制闸门理论中,脊髓电刺激的疗效无法完全清晰阐明,所以越来越多的临床医生和科研工作者希望更好了解其中机制,从而优化脊髓电刺激的临床治疗。脊髓电刺激术在电刺激的参数、电极放置位置、电极放置方式、商品化电极种类等各方面都已经开始进行不断完善、优化。有文献报道,脊髓电刺激治疗可以调节脊髓以及脊髓背根神经节内白介素以及肿瘤坏死因子水平。脊髓电刺激可以改变神经病理性疼痛神经炎性反应,STING通路又是中枢神经系统重要的免疫调节靶点。所以我们推测,脊髓电刺激会通过影响脊髓免疫相关的STING通路,从而调节神经病理性疼痛模型的内质网自噬水平,进而产生改变疼痛阈值以及改变疼痛导致的负性相关情绪的作用。研究方法:1、实验动物、模型手术和干预手段:本论文应用SPF级200～220g雄性SD大鼠脊神经结扎模型模拟神经病理性疼痛患者的临床表现;通过脊髓置管或单次脊髓穿刺进行脊髓鞘内给药;通过定制脊髓电刺激系统给予SD大鼠脊髓电极植入术,并且在造模后第二天到术后第七天,一共连续六天,每天进行半小时的经典模式脊髓电刺激（66%的机械值阈强度）。2、实验动物分组:实验第一部分:sham:SNL假手术组;SNL7d:SNL手术后七天组;SNL14d:SNL手术后14天组;在术后2,4,6,8,10,12,14天对SNL+RAP组,SNL+3-MA组,SNL+4-PBA组和SNL+TM组注射雷帕霉素（自噬激动剂）,3-MA（自噬抑制剂）,4-PBA（内质网应激抑制剂）,衣霉素（内质网激动剂）;sham+C组:假手术置管组加空白对照剂;SNL+C组:SNL手术加置管组空白对照剂;实验第二部分;sham组:假手术组,SNL7d:SNL术后7天组;SNL14d:SNL14天组;sham+V:假手术加空白组;SNL+V:SNL加空白组;SNL+R:SNL加RU521组。实验第三部分:con组:对照组;SNL+EI组:SNL手术加电极植入组;SNL+SCS组:SNL加脊髓电刺激组;SNL+V组:SNL手术加电极植入加置管、空白给药组;SNL+SCS+V组:SNL手术加脊髓电刺激加置管、空白给药组;SNL+SCS+TM组:SNL手术加脊髓电刺激加衣霉素组;SNL+SCS+2’3’c GAMP组:SNL手术加脊髓电刺激加c GAMP组。3、实验检测方法:本论文通过蛋白免疫印迹方法测定蛋白表达;通过免疫荧光用于检测指标共定位;通过缩足机械值阈检测机械敏感水平;通过热缩足潜伏期实验检测实验动物热敏水平;通过旷场实验对实验动物运动能力和焦虑水平进行检测;通过强迫游泳实验和悬尾实验检测实验动物的抑郁水平;通过X线确定脊髓电刺激电极位置。结果:第一部分:SNL与sham相比MWT和TWL减小（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;Grp78、FAM134b、p62、cleaved caspase3增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;RVM区域Grp78和Neu N共染（n=3）;SNL+4-PBA组和SNL+C组相比,MWT和TWL增高（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,Grp78,PERK/ATF4、IRE/JNK、ATF6、p62、c-caspase3显著降低,LC3和FAM134b增高（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;SNL+TM和SNL+C相比,MWT和TWL降低（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,Grp78,PERK/ATF4、IRE/JNK、ATF6、LC3、p62、c-caspase3显著升高,FAM134b降低（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;SNL+RAP组和SNL+C组相比,MWT和TWL增高（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,Grp78,PERK/ATF4、IRE/JNK、ATF6、p62、c-caspase3显著降低,LC3和FAM134b增高（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;SNL+3-MA和SNL+C相比,MWT和TWL降低（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,Grp78,PERK/ATF4、IRE/JNK、ATF6、LC3、p62、c-caspase3显著升高,FAM134b降低（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）。第二部分:SNL和sham相比,FST和TST不动时间增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;c GAS和p-STING表达增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;STING和LC3共定位,STING和c-fos共定位（n=3）;SNL+R和SNL+V相比,MWT和TWL升高（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,FST和TST不动时间减少（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）c GAS、p-STING减少（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）。第三部分:SNL+SCS和SNL+EI相比,FST不动时间减少（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=8）,OFT穿过旷场次数增多（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=8）,MWT增高（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;Grp78、LC3、p62、FAM134b、RTN3、sec24c、p-STING减少（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;SNL+SCS+TM和SNL+SCS+V相比,OFT穿过中央区次数减少（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=8）,FST不动时间增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=8）,MWT减少（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,LC3、p62、FAM134b、RTN3、sec24c、Grp78、p-STING增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）;SNL+SCS+2’3’c GAMP和SNL+SCS+V相比,OFT穿过中央区次数减少（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=8）,FST不动时间增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=8）,MWT减少（two-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）,LC3、p62、FAM134b、RTN3、sec24c、Grp78、p-STING增加（one-way ANOVA,*P＜0.05,n=6）。结论:1、在SNL模型中,可以通过增加脊髓内质网自噬缓解内质网应激,减少脊髓内质网自噬,加剧内质网应激;而过度的内质网应激导致内质网自噬流受阻,减少内质网应激导致内质网自噬流通畅。这说明在SNL模型中,脊髓中内质网自噬流受阻和内质网应激互为因果。2、在神经病理性疼痛模型中,负性相关情绪以及疼痛行为学恶化,并且STING通路磷酸化水平增加,c GAS抑制剂可以缓解SNL模型导致的疼痛以及负性相关情绪;抑制STING通路磷酸化可以增加脊髓内质网自噬水平;3、脊髓电刺激可以改善神经病理性疼痛导致的负性情绪行为学改变、缩足机械值阈行为学改变,并且通过减少STING通路磷酸化,增加脊髓的内质网自噬,从而缓解内质网应激;通过应用内质网应激激动剂,可以中和脊髓电刺激的镇痛效果同时缓解负性情绪,并且加重STING磷酸化;通过应用STING通路激活剂,可以中和脊髓电刺激的镇痛效果同时缓解负性情绪,阻断内质网自噬流。