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背景:肝癌是目前世界上发病率最高的癌症之一,而射频消融术是目前临床中针对早期肝癌的重要治疗手段,但经常存在肝癌消融后局部出现残留或消融不完全的情况发生,进而导致肿瘤复发和转移。本研究通过建立体内和体外肿瘤不完全消融模型,初步发现不完全消融后残留的肿瘤组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调。而当通过抑制Bcl-2的表达,可有降低效不完全消融后肿瘤局部残留及复发,进一步研究显示热消融还可诱导miR-210明显下调。而外源性导入的miR-210可降低Bcl-2蛋白水平,进而增敏热消融诱导的肿瘤灭活过程。此外,热消融后肿瘤细胞分泌的外泌体中的miR-210水平降低,其被受体细胞摄取后可有效降低细胞内的miR-210水平。由此可见,不完全热消融刺激肿瘤细胞产生的外泌体可调节miR-210表达水平,进而升高Bcl-2表达水平可能是造成复发的重要原因之一。通过靶向外泌体miR-210-Bcl-2轴可有效增敏HCC热消融治疗效果。目的:通过建立肝癌热刺激细胞模型及不完全消融BALB/c裸鼠移植瘤模型,通过Western blot及PCR等方法,探讨Bcl-2在肝癌热射频消融治疗后复发之间的相关性,并通过收集肝癌患者射频消融前后血样标本进行测序,并在细胞实验验证热刺激对相关miRNA表达的影响,通过提取细胞培养基中肝癌细胞分泌的外泌体,明确其内部miRNA表达变化,进一步探讨外泌体途径在肝癌射频消融术后肿瘤复发过程中起到的作用。方法:1、通过Western blot的方法,明确肝癌细胞在热刺激后细胞内的pAkt/Bcl-2通路的变化情况;2、通过抑制Bcl-2的表达,明确肝癌细胞在热刺激后细胞的存活能力是否发生变化,以及通过Western blot的方法明确Bcl-2表达情况;3、建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,通过体内实验进一步验证Bcl-2通路与RFA术后肿瘤残留及复发之间的关系;4、通过收集肝癌患者射频消融术前后患者血清样本,进行测序,明确血清样本中miRNA表达变化;5、筛选与Bcl-2存在靶向相关的miR-210,并通过PCR鉴定其在热刺激前后肝癌细胞内表达变化;6、通过提取外泌体,探明miR-210在热刺激前后肝癌细胞所分泌的外泌体中表达变化,同时进一步探明外泌体是否影响靶细胞内的miR-210表达变化,进而探讨外泌体是否参与到肿瘤射频消融后复发的机制中。结果:1、通过western blot的方法结果证实肝癌细胞在热刺激后内部的抗凋亡通路被激活,其中p-Akt及Bcl-2表达上调,Akt下调;2、通过抑制Bcl-2通路可降低肝癌细胞对于热刺激的耐受性,同时Western blot结果证实热刺激后的细胞联合使用Abt263后,其内部的Bcl-2蛋白表达被明显抑制;3、通过裸鼠成瘤实验,结果证实RFA可明显抑制肿瘤生长,而联合Bcl-2抑制剂后,肿瘤生长被明显抑制,免疫组化提示RFA组组织内Bcl-2表达上调,而联合组Bcl-2表达被抑制;4、通过收集临床中肝恶性肿瘤的患者射频消融手术前后血清样本进行测序,发现大量miRNA差异性表达,通过预测,提示miR-210序列与Bcl-2 m RNA的序列吻合度较高,其可能与Bcl-2表达升高存在一定的关系;5、通过PCR的方式,对热刺激前后的肝癌细胞进行检验,发现热处理后肿瘤细胞内miR-210明显减低,并与临床样本测序结果相一致;6、通过上调及下调肝癌细胞内miR-210表达水平,通过Western blot实验证实,miR-210可抑制细胞内的Bcl-2表达水平;7、通过上调miR-210水平可通过下调Bcl-2表达水平,进而减弱肝癌细胞对热刺激的耐受性;8、肝癌细胞热刺激后所分泌的外泌体miR-210下调,并可以影响靶细胞内miR-210表达水平,这也可能是外泌体介导肝癌消融后残留及复发的机制之一。结论:Bcl-2通路的激活可能是肝癌射频消融治疗后肿瘤复发的重要机制,通过抑制Bcl-2通路可以降低肝癌细胞对热刺激的耐受性,而外泌体可通过调节靶细胞内miR-210表达水平,调节Bcl-2的表达,进而影响肝癌射频消融术后肿瘤残留及复发。