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酸性橙Ⅱ(Acid OrangeⅡ,AOⅡ)是一种化工染料,主要作为纺织品、皮革制品、塑料及木制品的染色剂,也可在医学上用于组织染色。因其色泽艳丽、易于着色,常有商贩非法将其用于食品着色。有研究证实酸性橙Ⅱ有一定的致畸作用和致癌性,在食品加工中使用,可能引起食物中毒,长期食用甚至会致癌,因此严禁将其作为食品添加剂使用。国家卫生部2011年发布的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单中,明确规定禁止在食品中添加酸性橙Ⅱ。文献报道的对食品中酸性橙Ⅱ的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、反高效液相色谱法、超高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、荧光光谱法、电化学分析法等,这些方法需要的仪器设备贵重、样品处理过程更为复杂并要有专门的相关技术人员,难以满足现场快速检测。而免疫学检测方法操作简单易于携带,检测效率高,适合对大批量样品作现场快速筛选。目前仅有少数针对酸性橙Ⅱ的多克隆抗体,其免疫分析方法的特异性较低,效果较单克隆抗体差很多。本实验采用琥珀酸酐法和卤代羧酸法合成了酸性橙Ⅱ完全抗原,经过透析、鉴定后获得免疫原和包被原。用合成的免疫原分批免疫BALB/c小鼠,利用单克隆抗体技术、ELISA检测法及小鼠腹水制备等技术,制备出针对酸性橙Ⅱ特异性强、效价高的单克隆抗体,并建立ELISA检测方法。1.AO Ⅱ完全抗原的合成与鉴定酸性橙Ⅱ分子结构中没有能够直接与蛋白进行偶联的基团,分别采用一氯醋酸钠法和琥珀酸酐法对酸性橙Ⅱ中的酚羟基进行修饰,连接上带有羧基的间隔臂,再经活性脂法(NHS)与载体蛋白偶联,成功制备出酸性橙Ⅱ的免疫原和包被原。经紫外光谱扫描和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,可初步判定人工抗原偶联成功。经动物免疫和ELISA测定,均检测到产生抗体,表明两种抗原的制备是成功的。利用BCA试剂盒测得AOⅡ-BSA和AOⅡ-OVA 的蛋白浓度分别为2.35mg/mL 和1.60mg/mL;AOⅡ-BSA(B)和 AOⅡ-OVA(B)的蛋白浓度分别为4.12mg/mL和3.11mg/mL。2.AO Ⅱ单抗的制备以合成的人工抗原AOⅡ-BSA、AOⅡ-BSA(B)作为免疫原,按照实验室常规免疫程序免疫BALB/c小鼠(方法A合成的免疫2只,方法B合成的免疫3只)。以AO Ⅱ-OVA和AOⅡ-OVA(B)分别做包被原,五免后7d小鼠剪尾采血,测血清效价及抑制情况,血清效价达1:16000以上。经细胞融合、ELISA筛选和有限稀释法进行亚克隆,最终获得三株可持续分泌针对AOⅡ抗体的杂交瘤细胞株4D3、4F10和7E10。利用小鼠体内诱生法制备出抗AOⅡ单克隆抗体的腹水,其中4F10效价最好达96000,蛋白浓度为20.4mg/mL。腹水4F10经纯化后SDS-PAGE凝胶鉴定杂蛋白明显减少。交叉实验结果表明,该单抗与碱性黄、苋菜红、苏丹红Ⅰ、副品红、罗丹明B、胭脂红、柠檬黄、日落黄没有交叉反应,而对酸性橙Ⅱ的抑制率达100%。3.ELISA检测方法的建立用纯化后的4F10单克隆抗体建立检测AO Ⅱ的间接竞争ELISA方法,包被原最佳稀释浓度1:4000,纯化后抗体的最佳工作浓度1:24000,AOⅡ浓度在20～2000ng/mL时,标准曲线线性良好,线性方程为 y=0.3363x-0.2732(R2=0.989),IC50为 198.13ng/mL,LOD低于 16.69ng/mL,LOQ 为 52.22ng/mL。4.卤肉中AO Ⅱ添加回收试验卤肉样品添加回收实验,实验测定前先对卤肉样品进行前处理。将样品处理液稀释16倍以上时,可基本消除样品的基质干扰。在20～1000ng/mL范围内,曲线标准方程:y=0.3062x-0.2356,相关系数 R2=0.990,IC50 为 251.55ng/mL,LOD 低于 21.32ng/mL,LOQ为67.28ng/mL。用40、400和800ng/mL的AOⅡ标准液做添加回收实验,测得卤肉样品回收率在84%～92%之间。