论文部分内容阅读
集约化养殖模式造成生猪生产过程中肠道氧化应激日益严重,在氧化应激状态下,小肠上皮吸收功能和屏障作用受损,从而引起猪群健康度明显降低,直接影响生产性能。本课题组前期研究工作表明,猴头菇多糖（HEP）能够显著改善氧化应激造成的猪小肠上皮结构破坏和通透性降低等病理变化。本研究在此基础上,进一步探讨猴头菇多糖对氧化应激状态下猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）凋亡的影响,以期初步阐明HEP保护小肠上皮免受氧化损伤的分子机制,为HEP在生猪养殖中的应用提供科学依据。本试验以猴头菇为原材料,采用水提醇沉法获得粗糖,并采用DEAE-52纤维素柱进行分离纯化,得到纯度较高的多糖;检测HEP单糖组分、化学特性和红外、紫外光谱;同时测定HEP对·OH、O2-·、DPPH、ABTS自由基的清除作用及铁离子总还原能力。以IPEC-J2细胞为研究对象,构建过氧化氢（H2O2）氧化损伤模型,通过MTT法检测H2O2作用IPEC-J2细胞的最佳模型条件和HEP的安全浓度。同时采用流式细胞术测定IPEC-J2细胞凋亡率、胞内活性氧（ROS）水平以及细胞周期;用酶联免疫荧光法（Elisa）检测HEP对氧化应激 IPEC-J2 细胞中半胱天冬酶 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、DNA修复酶（PARP）、细胞色素C（Cyt-C）含量的影响;通过Western Blot法观察IPEC-J2细胞凋亡的相关蛋白:B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、Bax、Bad、肿瘤坏死因子受体（TNFR1）、FAS、FASL、的表达情况。试验结果如下:（1）通过凝胶渗透色谱法,测定出HEP由甘露醇,鼠李糖,葡萄糖,半乳糖和岩藻糖组成,摩尔比为0.8:0.1:9.7:10:1.6;采用理化性质组分分析显示HEP不含淀粉,包含少量糖醛酸和多酚类物质;紫外分光光度计扫描结果显示HEP不含有蛋白质和核酸类物质,傅里叶红外光谱扫描结果显示HEP包含有典型的多糖类特征吸收峰。试验结果说明了 HEP糖含量较高且性状良好,分子量均一,符合接下来的细胞试验要求。（2）测定HEP对·OH、O2-·、DPPH、ABTS自由基的清除作用和铁离子总还原能力,结果表明HEP具有较强的体外抗氧化能力。（3）利用MTT法测定H2O2和HEP对IPEC-J2细胞存活率的影响,结果选取0.4 mM作为最佳氧化损伤模型浓度,10～350 μg/mL为HEP 安全浓度,最后选择 10μg/mL,50μg/mL,100μg/mL 作为 HEP低、中、高剂量组。（4）采用流式细胞术检测HEP对氧化应激状态下IPEC-J2细胞凋亡率、ROS含量以及细胞周期的影响。结果显示:提前加入HEP进行干预的氧化应激状态下IPEC-J2细胞凋亡率显著降低（P<0.05）,说明10-100 μg/mL HEP可以显著抑制H2O2诱导的IPEC-J2细胞凋亡。ROS含量相对于模型组极显著降低（P<0.01）,说明了 HEP对H2O2损伤细胞时产生的ROS具有明显清除作用。G2期细胞数量相对于模型组显著降低（P<0.05）,说明了 HEP对细胞G2期阻滞有缓解作用。表明HEP对抑制氧化应激状态下IPEC-J2细胞凋亡有明显作用。（5）与空白对照组相比,H2O2极显著地上调了促凋亡蛋白Bax、Bad、TNFR1、FAS、FASL的表达水平,极显著下调了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平（P<0.01）。HEP的浓度在10-100 μg/mL时,在一定程度上均能抑制氧化应激状态下Bax、Bad、TNFR1、FAS、FASL的蛋白分泌,同时促进Bcl-2蛋白表达,并有一定的量效关系（P<0.05）。因此,HEP在一定程度上抑制了氧化应激状态下IPEC-J2细胞促凋亡相关蛋白表达水平,缓解了细胞凋亡造成的损伤,提高细胞存活率。综上所述,本研究初步阐明HEP的单糖组成、光谱吸收特征等理化性质,明确HEP具有显著的体外抗氧化作用,发现HEP能够抑制氧化应激导致的IPEC-J2细胞凋亡,其作用机制与内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径都有密切关系。