温度和硝酸盐限制对三角褐指藻DMSP生成的影响以及该通路中关键基因的研究

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二甲基丙酸内盐(dimethylsulfoniopropionate,DMSP)是海洋中重要的溶解有机硫,它及其分解产物——二甲基硫(dimethylsulfide,DMS)是参与海洋硫循环和调节全球气候的重要物质,生态意义极其重要。DMSP是藻类重要的抗氧化剂、冷冻保护剂和调节渗透压的物质,因此对浮游生物适应环境变化有着重要的调节作用。目前普遍认为,藻类是DMSP的主要贡献者,但是对藻类中DMSP的生产途径还有待进一步研究。硅藻是浮游植物的重要组成者,本文以模式硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)为研究对象,针对DMSP合成通路中S-腺苷-L-蛋氨酸依赖性甲基转移酶(S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferasc,SAMMTase)基因,通过比较基因组学,查找到与该酶诱导的转甲基反应相关的4个可能基因。通过分析和预测这些基因编码蛋白的结构和功能,结合室内实验进一步探讨藻类DMSP合成的机制和影响因素,筛选出三角褐指藻内与DMSP介成反应相关的转甲基酶的合成基因PtMMT,即Phatr348704。最后通过Thra ocean数据库分析全球范围内该基因的分布和表达情况。具体研究结果如下:1.三角褐指藻中存在海链藻转甲基酶(Thalassiosira methyltransferase,TpMMT)的4条同源基因:Phatr3J48704、Phatr3J15217、Phatr3J33530 以及Phatr3J10824,均属于SAM MTase同源超家族,与岩藻黄素-叶绿素a/c 结合蛋白(FCP)以及脂肪酸、磷脂和核酸代谢相关基因共表达。2.三角褐指藻Ptl株系在20±1℃,培养光强为120 μmol photons m-2s-1,光暗周期为12L:12D的条件下培养11天,培养第5天和第11天内DMSP产量并无显著变化,可能与不同的培养时间有关。3.18摄氏度条件下,三角褐指藻Ptl株系DMSP总产量(DMSPt)提高了近16.98%,单位细胞DMSPt稍微上升,但无统计学差异;胞外DMSP(DMSPd)和胞内DMSP(DMSPp)总产量也提高了近62.79%和12.88%。藻细胞可通过积累胞内DMSP(DMSPp)来抵抗低温的影响,并且在温度降低的情况下,只有Phatr3J48704的表达量提升。4.硝酸盐限制会抑制三角褐指藻Pt1和Pt4两个株系的细胞生长,但单位细胞DMSPt含量提高超过10倍。究其原因,可能有三点:细胞可能通过产生DMSP来进行渗透压调节:硝酸盐限制下细胞粒径变小、可能造成被捕食概率增大,藻细胞可能通过增加单位细胞的DMSP产量来抵御捕食者;DMSP具有抗氧化作用,用来抵抗C:N比例失调情况下产生的高毒性活性氧。由于Pt4和Ptl之间由于原始生存环境不同而导致的遗传差异,使得Pt4对于硝酸盐限制的反应更为明显,DMSP产量提升更为显著。与此同时可以检测到Phatr3J48704和Phatr3J33530的表达量显著上调。5.根据上述结果,筛选出三角褐指藻中DMSP合成相关基因Phatr3J48704,编辑合成三角褐指藻转甲基酶(Phaeodactylum methyltransferase,PtMMT)。经Tara ocean的分析,该基因在全球海区的分布主要集中于沿海海岸,在真光层中表达量较高,低氮和低磷条件下能明显促进该基因的表达;少量原核生物(主要是蓝细菌)以及较多的真核藻类中包含该基因的同源序列。6.利用反义RNA原理和CR1SPR/Cas 9技术分别构建了针对三角褐指藻PtMMT的敲减和敲除质粒,并进行了甘油保种。
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