论文部分内容阅读
妊娠期糖尿病(Geatational diabetes mellitus,GDM)是常见的妊娠高危因素之一,在我国孕妇中的发生率为2-5%,并有逐年上升的趋势。既往对于妊娠合并糖尿病的研究发现,母体高血糖通过胎盘影响胎儿,是胎儿致畸的主要因素。GDM是常见的致先天性心脏病的影响因素,尤其在妊娠前8周母体血糖控制不好的病例中,严重地影响了心脏的分化与发育。糖尿病母亲分娩胎儿除了先天性心脏病高发以外,胎儿心肌肥大,就占糖尿病母亲分娩胎儿的30%。尤其是室间隔和左心室的肥大最为常见,而且心肌肥大影响生后新生儿的生命活动。因此,有学者提出心肌细胞肥大可能是妊娠期高血糖致胎儿心脏结构功能改变的原因之一。但是,高糖通过怎样的生理机制引起心肌细胞肥大从而导致胚胎心脏发育异常仍不是非常明确。
在心脏的发育与疾病发生过程中,会受到众多分子通路的影响,如RAS通路MAPK通路Calcinurin通路,生长因子信号通路,其中TGF-β/Smad4通路就是一个重要的通路。
TGF-β是一种具有多功能活性的生长因子,参与了一些基本的生物过程,如细胞增殖、分化、凋亡、黏附、器官形成等。在心脏中TGF-beta是自分泌,旁分泌生长因子,在TGF信号通路中,Smad4发挥着决定性的作用,Rsmad(receptor activited Smads)形成的复合物的核移位在TGF信号转导中起限速作用,Smad4是该通路的核心因子。Smad4在其他转录因子的协同作用下,将TGF信号由细胞浆传入细胞核,激活特定的靶基因,通过介导G2期阻滞来促进凋亡,抑制细胞生长。Smda4分子在心室重塑过程中的重要作用。在房室管形成阶段,TGF-β是刺激内皮细胞向间质细胞转化,最终形成房室瓣膜和间隔的重要分子,由此推断TGF-β/Smad4通路通过Smad4转化在糖尿病诱发的先天性心脏病中起一定作用。
有学者发现心肌细胞对TGF-β分子反应性的改变可能是引起心肌肥厚的一种机制。在对小鼠心肌细胞转染Smad4的质粒后同肾上腺素phenylephrine(PE).一起极大地加速了凋亡细胞,由此认为Smad4在心肌细胞由肥大向凋亡的诱导中起到转化作用,是导致心衰和心肌重构的主要因子。
在高糖环境中常伴随低氧的发生, HIF-1α是对缺氧的适应性的主要调节分子,因此设定HIF-1α基因作为研究对象。它能激活许多转录因子。HIF-1α的表达和激活还受其他一些主要的信号转导途径的调节,例如PI-3K及ERK/MAPK途径等。长期暴露于高糖环境胎儿的心脏畸形率明显升高(在糖尿病肾病和视网膜病变中HIF-1α的表型变化决定了疾病的病理变化水平。由此可见在糖代谢中HIF-1α是主要的调节因子。在HIF-1α诱导的转化反应中多半有Smad4的参与。由此可见,HIF-1α和Smad4在糖代谢环境中都起到调节作用。
P27基因是近年来发现的一种抑癌基因,其编码的P27蛋白是细胞周期素(cyclin)依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclin depenndent kinase inhibitor, CDKI)可直接抑制cyclin-CDK复合物的生物学活性。目前认为p27是TGF-β、cAMP及其他细胞外因子诱导细胞生长停滞的主要介质
心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)在正常成人心室肌ANP的表达是很微量的。在人肥厚的心脏,ANP的表达显著增加,本实验以ANP为心肌肥大的标志物,验证心肌细胞的肥大与损伤。
总之,我们通过临床观察到了妊娠期糖尿病孕妇胎儿心肌肥大,由此我们将在体外人的细胞水平验证体外高糖水平下细胞的形态和相关因子的表达变化,探索Smad4信号通路上下游相关基因在高糖诱导心肌细胞肥大过程中的交互联系,有利于揭示高糖环境诱导心肌细胞肥大的分子机制,也为防治高糖对心肌细胞的影响提供理论依据。
方法:
第一部分:应用荧光倒置显微镜和
RT-PCR法观察在48小时不同浓度糖梯度培养下的人心肌细胞的体积变化和Smad4的表达量差异。
1、培养心肌细胞,贴壁达到70%后加糖,使培养皿内糖浓度分别达到10mMol/L,20mMol/L,30mMol/L,40mMol/L.,48小时后观察细胞体积变化。
2、应用RT-PCR法验证细胞肥大的标志物ANP的表达,和表达量与肥大关系。
3、RT-PCR法和western blot法检测Smad4在不同浓度糖梯度培养下的人心肌细胞中mRNA和蛋白的表达量差异。
第二部分:构建Smad4的RNA干扰质粒载体,脂质体2000介导转染HCM细胞,通过检测干涉后的HCM细胞在高糖情况下的Smad4的表达变化和细胞肥大的形态变化,验证Smad4对心肌肥大的影响。
1、验证构建的Smad4干涉质粒的干涉效果,效果明显后,转染HCM细胞,CoRNA作为对照,GFP组作为转染效率验证,24小时后GFP验证转染效率达到70%,同时培养基添加糖30mMol/L。48小时后显微镜观察细胞肥大体积的变化。
2、通过RT-PCR和western blot进一步验证Smad4干扰后,在肥大细胞中的表达变化。
第三部分:mRNA和蛋白水平检验在用糖培养的HCM细胞中HIF-1a的表达变化,构建的HIF-1a的表达和干涉质粒,脂质体2000介导转染HCM细胞,通过RT-PCR和western blot过表达和干涉后的HCM细胞在高糖情况下的Smad4的表达变化,验证HIF-1a对Smad4在心肌肥大中表达变化的影响。证明HIF-1a对Smad4的调节作用。
第四部分: TGF-B相关基因P27在加糖环境下心肌肥大中的表达变化,RT-PCR和western方法检测Smad4 siRNA干扰后P27的mRNA表达变化。
结果:
第一部分:我们在体外培养人心肌细胞(HCM),应用荧光倒置显微镜和RT-PCR法观察细胞体积的变化,本实验检测Smad4在含不同的糖浓度的培养基的HCM的表达量。利用安装在显微镜的Nikon软件获取图像,测量细胞表面积,每空测5个视野,每个视野测10-15个细胞,取其平均值,每组重复3次。观察到的细胞面积随着浓度增加不断增大,在40mMol/L浓度时体积变小细胞碎片增多,提示细胞走向凋亡。ANP的表达与细胞肥大相一致,Smad4在经48小时高糖培养下的HCM中表达随浓度的增加不断增强,而且在30mMol/L糖浓度时表达最强,40mMol/L浓度时表达明显减弱。提示Smad4与高糖刺激下的心肌肥大密切相关。
第二部分:构建Smad4的RNA干扰质粒,验证,转染,转染CoRNA同样高糖环境培养和未转染无糖的比较,细胞形态上Smad4干扰组与转染CoRNA组比较差异有统计学意义,即CoRNA组面积增大显著P<0.05,Smad4干扰组与正常组比较细胞面积差异无统计学意义。
RT-PCR和western blot进一步验证Smad4干扰后,在肥大细胞中的表达变化。发现转染CoRNA和Smad4 siRNA比较Smad4的mRNA和蛋白表达水平显著降低。说明高糖诱导心肌细胞中Smad4的表达下降,减少了细胞的肥大。证明了Smad4对高糖环境下心肌肥大的调节作用。
第三部分:HIF-1α在高糖环境培养的心肌细胞中,基因的mRNA和蛋白表达水平随着糖浓度的增加不断增强,40mMol/L时表达下降,与心肌细胞体积的变化成密切相关。
HIF-1α的表达质粒转染心肌细胞,转染经GFP验证成功后,加糖使培养基含糖30mMol/L与空载PC3.1同样加糖组和正常未加糖细胞组做比较,加糖转染HIF-1α表达组的细胞Smad4基因表达和蛋白表达水平显著升高,ANP基因表达增强。
HIF-1α的干涉质粒转染心肌细胞,转染经GFP验证成功后,加糖使培养基含糖30mMol/L与空载PC4.1同样加糖组和正常未加糖细胞组做比较,加糖转染HIF-1α干涉组的细胞Smad4基因表达和蛋白表达水平显著下降,ANP基因表达减少。
第四部分:经Smad4干涉的加糖环境下HCM肥大中P27的表达与对照组的比较说明,P27在HCM肥大中表达受到Smad4的调节。
证实了Smad4在细胞高糖环境下对P27的调节作用。
结论:
在体外高糖诱导下的HCM的Smad4表达随着高糖水平不断升高,达到30mMol/L时为最大促肥大浓度,并且能通过改变自身表达量影响细胞肥大,HIF-1a可以调节Smad4的表达,体现低氧与高糖诱导HCM肥大的相互联系,在高糖诱导HCM肥大中Smad4也影响着下游P27的表达。