在整形外科中,皮肤软组织扩张术常被应用于皮肤损伤处的修复和体表器官的再造。在修复重建中,与其它方式相比,皮肤扩张术较为安全且效果较好,但仍存在一些缺点,例如出现并发症、治疗时间长及病人心理负担较大等问题。组织学上可见,持续的牵拉会引起皮肤中的胶原断裂,皮肤的真皮层变薄,可能引起诸如扩张器外露等并发症的发生。因此,对扩张皮肤中胶原的调控成为了解决真皮层变薄的关键。皮肤中胶原的合成与分解常受一系列细胞因子调控,但在扩张条件下,能发挥此作用的细胞因子尚不清楚。因此,需寻求一种高效的细胞因子来对扩张中的胶原进行调节。色素上皮衍生因子在成人正常组织中(脑、肝、骨、眼、卵巢等)广泛存在,以往研究表明,在皮肤的创伤处及其他损伤组织中,有PEDF表达的上调,并且PEDF能参与胶原合成的调节。因此,我们设想,在扩张的皮肤中,PEDF可能表达于皮肤中的某个层次,并且能够调控扩张皮肤中的胶原合成。本文第一部分利用人、小鼠头部的扩张模型及大鼠背部皮肤扩张模型进行皮肤扩张,通过免疫荧光染色、PCR、Western Blot及ELISA等方法,比较扩张组和对照组的PEDF在小鼠及人的皮肤中、大鼠渗液中的表达差异,旨在探索扩张是否能够上调皮肤及皮肤微环境中PEDF的表达;本文第二部分利用第一部分的结论进行体外实验,探索在扩张引起的缺氧环境下,PEDF是否能调控胶原的合成。同时对PEDF诱导巨噬细胞极化到何种方向进行探讨,探索PEDF能否通过极化巨噬细胞间接调控胶原的合成。第一部分人的皮肤、小鼠及大鼠皮肤扩张模型中PEDF的表达特征目的:探讨在皮肤扩张术中,皮肤中色素上皮衍生因子(PEDF)的表达特征。方法:取人的扩张3个月的皮肤10例及正常皮肤6例。除此之外,C57BL/6小鼠16只、SD大鼠20只,设置扩张组和对照组,将大、小鼠随机分配到两组中,对照组为假扩张组。将总体积为1mL的皮肤扩张器埋置于小鼠头顶部,层次为紧贴骨膜上,并在术后1周时,向扩张组老鼠埋置的扩张器中注射生理盐水。注射频率为每周2次,0.5mL/次,注液前后记录囊内压,使扩张后囊内压保持在6Kpa,以保证恒压扩张。对照组的扩张器中不注射生理盐水。对扩张3周后的小鼠皮肤进行取材,并对皮肤中PEDF的mRNA含量和PEDF蛋白水平分别进行测量,利用免疫荧光染色检测小鼠扩张3周皮肤及临床获取的人的皮肤中PEDF的表达水平、分布、主要阳性表达细胞类型,在Nikon C2共聚焦显微镜下拍照,利用Image Pro Plus软件进行分析;为模拟扩张皮肤中的缺氧环境,将HaCaT细胞放入低氧培养箱中进行培养,以明确影响表皮细胞PEDF基因转录水平的主要组织微环境因素。由于在大鼠模型中,获得扩张后产生的渗液较为容易且数量较多,因此利用SD大鼠背部扩张模型,将总体积为10 mL的皮肤扩张器埋置于大鼠背部,层次为皮下,自埋置后第8天起,向扩张囊中注射生理盐水,每周2次,每次注水至囊内压保持在8Kpa。收集扩张前后产生的渗液,取材,利用ELISA试剂盒,测量渗液中PEDF的含量,并使用SPSS 13.0软件做相关统计学分析。结果:注水后,与对照组相比,小鼠与人的皮肤中PEDF表达均上调,并主要表达在表皮层,且小鼠皮肤组织扩张后3周时皮肤两组之间PEDF的mRNA水平和蛋白水平表达的差异均具有统计学差异。大鼠皮肤扩张后所取得的渗液中,与对照组相比,扩张能引起PEDF的表达水平上调,并且上调水平随时间延长而增大。体外利用HaCaT表皮细胞系进行体内结果的验证,在缺氧处理后,取0、1、3、6、9h的细胞,检测到细胞PEDF mRNA表达水平显著上调并维持在较高水平。结论:皮肤扩张能够引起皮肤中PEDF的表达上调,并且其主要分布在皮肤的表皮层,除了皮肤中的表达,PEDF能够分泌至组织微环境中;而体外可发现,模拟皮肤扩张的缺氧微环境,PEDF的表达能够维持在较高的水平,且PEDF的特征性表达也为我们下一步对PEDF的调控作用进行探究奠定了基础。第二部分PEDF在扩张条件下对胶原合成的调控作用目的:探讨PEDF在皮肤真皮层中调控胶原的合成作用。方法:体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7以及胎鼠成纤维细胞ICR,在缺氧条件下,利用PEDF对细胞进行干预,利用PCR、流式细胞技术、荧光细胞染色等方法探讨PEDF对巨噬细胞的极化作用;利用Transwell共培养方法共同培养巨噬细胞和成纤维细胞,以探究PEDF联合巨噬细胞对胶原合成的综合作用。并且,为了进一步证明PEDF的作用,利用PEDF的受体抑制剂与巨噬细胞表面的PEDF受体结合,以抑制PEDF对巨噬细胞的极化作用,利用相同的方法进行共培养,进一步证明PEDF联合巨噬细胞对胶原合成的综合作用。结果:在缺氧条件下,经PEDF处理过的巨噬细胞中,M1-marker(iNOS,TNF-α,MCP-1)显著增高,而M2-marker(Arg-1,Ym-1,IL-10)增加不明显。在成纤维细胞中添加PEDF,发现I型和III型胶原的合成没有明显变化,而在Transwell实验中,胶原最终合成量减少,且差异具有统计学意义。抑制巨噬细胞上的PEDF受体后,I型和III型胶原合成增加。结论:PEDF在扩张缺氧的条件下能通过与巨噬细胞膜上PEDF受体结合,使巨噬细胞向M1方向极化,并以巨噬细胞为靶点,减少胶原的合成。