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目的：随着我国经济的快速增长,社会活动的频繁增加,尤其是交通事业的快速发展,使颅脑创伤成为一种常见的损伤。另外,脑挫伤也是法医学检案实践中常见的一种机械性脑损伤,因此要建立一个适当的、符合实际且理想的脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)模型对研究脑损伤意义重大。1981年Feeney成功的建立了大鼠脑组织挫伤模型,该模型可以模拟类似于人类临床上见到的脑挫伤的局灶性损伤。但是该模型在应用当中还存在一些不足,比如易于出现二次反弹的损伤。本实验参照Edward介绍的方法,采取颅骨开窗的打击方式,目的是为了尽量保证动物之间损伤的部位和损伤的程度相保持一致。脑挫伤(brain contusion)是一种常见的原发性脑损伤,指由于外力作用后脑组织在颅内作直线加速或减速运动,或旋转运动,脑表面与颅骨内面或颅底碰撞、摩擦而形成。其症状一般表现为不同程度的意识障碍,更严重者可导致死亡。正常情况下,脑组织内没有诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)蛋白的表达,在炎症、缺血、缺氧及创伤情况下受损伤周围会出现iNOS蛋白的阳性表达,并呈现一定的时间规律性,其细胞定位主要是部分神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞及炎性浸润的中性粒细胞及巨噬细胞。微管相关蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP-2)是一种热稳定的磷蛋白,属于结构性微管相关蛋白家族,主要存在于中枢神经系统神经元胞体和树突,是哺乳动物脑中最丰富的蛋白之一。MAP-2是神经元缺血损伤的敏感指标,可作为颅脑创伤神经元损伤的早期标记物。本实验通过模拟大鼠脑挫伤模型,应用免疫组织化学(SP)染色的方法,检测实验性大鼠脑挫伤后不同时间内iNOS和MAP-2蛋白表达及其与损伤经过时间的关系,可望为法医学实践中对颅脑损伤时间的推断提供科学的理论依据。
方法：⑴将实验动物随机分为对照组(5只)和实验组,实验组按损伤后3小时、6小时、12小时、1天、3天、5天、7天和14天8个时间点分组,每组6只。⑵利用改造的Edward自由落体装置,撞击大鼠头部制造脑挫伤模型,记录动物的行为学变化,在相应时间点取脑组织,并固定做石蜡埋块。⑶在HE染色观察的基础上,采用免疫组化(SP法)观察损伤后不同时间内iNOS和MAP-2蛋白阳性表达的变化,利用Image-Pro Plus5.0进行图像分析,测量挫伤灶周围iNOS和MAP-2的阳性细胞率,并记录实验数据。⑷统计分析:所有数据用-x±s表示,用SPSS12.0统计软件对数据进行单因素方差分析,采用LSD～t法进行两两比较,检验水准α=0.05。
结果：①受打击损伤后多数大鼠出现短暂昏迷,心率发生改变,自主呼吸由慢接近正常,苏醒后缓慢跑动,且反应迟钝。②损伤后早期(＜1d),可见挫伤周围局部蛛网膜下腔出血,大脑皮层内有多个大小不一、散在的出血灶,部分伴有脑组织轻度水肿。在伤后3天,大脑皮质及海马内可见以神经元细胞肿胀、变性、坏死,周围胶质细胞增生为主要病理改变。脑损伤后7天,脑组织内坏死神经元增多,呈灶状,胶质细胞反应性增生,可见明显的胶质瘢痕。对照组末见明显改变。③损伤后iNOS的表达变化观察,对照组中未见着色阳性细胞出现,而在实验组的挫伤灶周围区域,皮质、海马和齿状回及胼胝体存在iNOS阳性染色细胞,表达区域主要集中在损伤皮质周围及海马。脑创伤后iNOS的活性明显提高。伤后6小时即可见散在的梭形或三角形的iNOS阳性细胞出现;伤后1天,在皮质和海马区iNOS的阳性表达较对照组显著增加(P＜0.05);在损伤后3天表达达到高峰(P＜0.05),伤后5天iNOS阳性表达有所下降,伤后14天在损伤灶周围仍见有iNOS阳性细胞表达。④损伤后MAP-2的表达变化观察,在正常对照组中,MAP-2的染色细胞主要位于神经元的胞体和树突,阳性反应呈棕黄色。MAP-2在脑损伤后3小时表达明显下降(P＜0.05),在伤后1天MAP-2蛋白丢失达到高峰(P＜0.05),伤后3天MAP-2蛋白开始恢复表达,且于伤后5天逐渐增加,到伤后14天损伤灶周围的表达接近正常组(P＜0.05)。
结论：⑴本实验利用改造的Edward自由落体打击装置,模拟大鼠脑挫伤动物模型,在HE染色的基础上,对大鼠脑组织进行镜下病理学观察,发现符合脑挫伤的组织病理形态学改变,脑挫伤动物模型制作成功。⑵脑损伤后iNOS和MAP-2的表达强度均与损伤经过时间之间密切相关,并呈现出一定的时间规律性,可望作为推断脑损伤时间的参考指标。⑶在脑损伤后,iNOS和MAP-2两项免疫组织化学指标均有阳性物质的出现、高峰和下降的过程,并且此过程与损伤经过时间密切相关,因此把两项指标结合起来进行检测研究,综合起来分析,联合判断,有利于对脑挫伤早期及更长时段损伤时间的判断,且更具科学性。