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目的:本研究建立I型糖尿病（diabetes mellitus,DM）小鼠模型和高糖刺激体外培养H9c2心肌细胞,同时应用海藻糖干预,探讨海藻糖对高糖损伤的心肌细胞的保护作用,进一步探讨PK2/PKR信号通路在海藻糖保护高糖损伤心肌细胞中的机制,为海藻糖应用于糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）治疗提供理论依据。方法:1.C57BL/6J小鼠连续5天腹腔注射50mg/kg/d链脲佐菌素（STZ）建立糖尿病小鼠模型。7 d后测定随机血糖值,若≥16.7 mmol/L,则认为糖尿病小鼠模型建立成功。模型建立后分组为正常对照组（Con组,n=15）、糖尿病模型组（DM组,n=15）、海藻糖对照组（Con-TLS组,n=15）和海藻糖治疗组（DM-TLS组,n=15）。Con-TLS组和DM-TLS组连续两天腹腔注射TLS溶液（1 mg/g/d）,后给2%（w/v）海藻糖饮水24 w;Con组和DM组普通饮水24 w。每4 w测定小鼠体重和随机血糖,实验末,进行糖耐量和超声心动图检测;处死小鼠后测定小鼠心脏、肺脏重量系数（HW/BW、LW/BW）;全自动生化分析仪测定血清心肌酶和脂质表达;HE染色、Masson三色染色和透射电镜观察心肌显微结构和自噬泡数量;TUNEL染色法观察心肌组织的凋亡情况;Western blot法测定心肌中凋亡相关蛋白、焦亡相关蛋白、自噬相关蛋白以及PK2/PKR信号通路蛋白表达水平。2.体外培养大鼠H9c2心肌细胞,将其随机分组（1）正常对照组（NG）、高糖模型组（HG）、海藻糖低（HG-TLS（50））、中（HG-TLS（100））、高（HG-TLS（150））剂量组、药物对照组（NG-TLS（150））;（2）正常对照组（NG）、药物对照组（NG-TLS）、PKRA7对照组（NG-PKRA7）、高糖模型组（HG）、海藻治疗组（HG-TLS）、高糖加海藻糖加抑制剂组（HG-TLS-PKRA7）。细胞同步化后分组干预72 h,收集细胞。Western blot法测定H9c2细胞中凋亡、焦亡、自噬相关蛋白以及PK2/PKR信号通路蛋白表达水平。结果:第一部分海藻糖对I型糖尿病小鼠心肌损伤保护作用及机制的研究1.不同时间点动物随机血糖、体重变化:随着病程延长,Con组和Con-TLS组小鼠随机血糖值处于稳定的低水平状态,DM组和DM-TLS组小鼠随机血糖值也一直处于稳定的高水平状态;随着病程延长,Con组和Con-TLS组小鼠体重逐渐升高,DM小鼠体重不断降低呈缓慢下降的趋势。24 w,与Con组相比,DM组小鼠体重明显降低。DM-TLS组小鼠体重较DM组明显增高（P＜0.05）但未达到正常水平,TLS对正常小鼠体重无影响（P＞0.05）。2.动物脏器重量系数:与Con组相比,DM组小鼠HW,LW显著降低,HW/BW,LW/BW增加。TLS干预降低了DM小鼠的HW/BW,LW/BW。TLS对正常小鼠脏器重量无影响（P＞0.05）。3.糖耐量结果:腹腔注射葡萄糖120 min时DM组血糖值仍处于高水平,Con,Con-TLS,DM-TLS组小鼠血糖均回落至与初始血糖值无显著差异水平;DM组AUC明显高于Con,与DM组相比,DM-TLS组AUC轻度降低,仍处于高水平（P＞0.05）。TLS对Con组无影响。4.生化指标检测:与Con组相比,DM组小鼠血清中TC,TG和心肌酶活力显著升高（P＜0.05）,TLS部分或显著降低了异常升高。TLS对正常小鼠血清血脂水平和心肌酶活力无影响（P＞0.05）。5.超声心动图结果:DM组小鼠HR、EF、FS、E/A ratio较Con组降低（P＜0.05）。TLS治疗后,HR、EF、FS、E/A ratio增高。6.HE染色结果:Con组小鼠心肌肌纤维成行排列紧密,形态规整,肌丝粗细均匀。DM组小鼠心肌肌纤维细胞出现溶解,断裂,空泡,排列不紧密,肌丝粗细不均。DM-TLS组小鼠心肌形态较DM组规整,肌纤维断裂和空泡化损伤明显减少。Con-TLS组小鼠心肌形态与Con组相似。7.Masson染色结果:与Con组相比,DM组小鼠心肌中胶原沉积显著增多。DM-TLS组小鼠心肌间胶原沉积明显减少,Con-TLS组小鼠心肌形态和纤维化程度与Con组相似。8.透射电镜自噬泡结果:与Con组相比,DM组中自噬泡的数量明显减少,而TLS增加了DM组自噬泡数量,Con-TLS组自噬小体数量较Con组轻微增多。9.TUNEL法检测心肌细胞凋亡结果:DM组小鼠心肌内凋亡小体较Con组增多,TLS治疗后凋亡小体数量减少。Con-TLS组凋亡小体数量较Con组无变化。10.Western blot检测蛋白表达:DM组小鼠心肌组织中Cleaved-Caspase3、NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、p62蛋白表达水平以及Bax/Bcl-2比值均显著高于Con组（P＜0.05）,Beclin-1、Atg5、PK2、PKR1、PKR2蛋白表达水平和LC3II/I比值显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。TLS显著逆转了DM小鼠心肌中蛋白的表达。第二部分海藻糖对高糖损伤H9c2心肌细胞的保护作用以及机制的研究1.Western blot检测蛋白表达:（1）HG组Bax/Bcl-2比值和Cleaved-Caspase3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,TLS治疗后显著降低（P＜0.05）,TLS对NG组细胞凋亡蛋白表达无影响。（2）HG组焦亡相关蛋白表达较NG组均显著增高（P＜0.05）。TLS各治疗组焦亡相关蛋白表达水平显著或部分降低,NALP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达呈剂量依赖性降低（P＜0.05）。（3）HG刺激显著降低了Beclin-1,Atg5蛋白表达水平和LC3II/I比值（P＜0.05）,显著升高了p62蛋白表达水平（P＜0.05）,其中HG-TLS（100）显著性地逆转了各组蛋白表达的异常至正常水平（P＜0.05）。TLS对NG组自噬蛋白表达无影响（P＞0.05）。（4）与NG组相比,HG组PK2、PKR1、PKR2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。TLS（100）显著性地升高了PK2、PKR1、PKR2蛋白表达至正常水平（P＜0.05）,TLS对NG组PK2/PKR信号通路蛋白表达无影响。（5）PKRA7显著抑制PK2蛋白表达水平（P＜0.05）。PKRA7显著逆转了HG组TLS导致的PK2/PKR蛋白表达升高。此外,TLS对NG组PK2/PKR信号通路蛋白表达无影响。（6）PKRA7可部分升高TLS诱导的Cleaved-Caspase3,NALP3,Caspase-1,IL-18,IL-1β蛋白表达水平和Bax/Bcl-2比值的降低（P＞0.05）。PKRA7对HG-TLS组自噬相关蛋白表达无影响。结论:海藻糖对高糖导致的心肌损伤具有保护作用,其机制可能与抑制心肌细胞凋亡,焦亡,增强自噬有关。海藻糖也可能是通过激活PK2/PKR信号通路,从而抑制细胞凋亡和焦亡而对高糖损伤的心肌细胞发挥保护作用。