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拟穴青蟹(Scylla paramamosain),简称青蟹,是我国重要的海水养殖蟹类,味道鲜美、营养价值高。其在人工养殖过程中容易受水质和病原微生物等的威胁,生长和发育受影响,尤其在脆弱的幼体期,极高的死亡率严重影响青蟹养殖业的健康发展。因此,对青蟹早期发育阶段的先天性免疫作用的研究至关重要。实验室前期的转录组学数据显示,对青蟹幼体进行人工感染后,一些免疫相关基因被显著地诱导表达,主要包括抗菌肽、Toll和IMD信号通路、proPO系统、补体系统和凝血系统等。本研究利用本实验室前期构建的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)感染的青蟹大眼幼体转录组数据库,筛选获得了一个新的Crustin同源基因,命名为SpCrus7。Crustin是一种广泛存在于甲壳动物中的抗菌肽,已证明对病原菌感染具有显著的免疫应答能力。本文研究了 SpCrus7基因在青蟹体内的表达特性及其重组表达蛋白和人工合成肽段SpCrus722-42的抗菌功能,并初步探讨了其抗菌机制。本论文主要研究成果如下:1.克隆获得了拟穴青蟹抗菌肽SpCrus7基因的全长cDNA序列(GenBank no.MK733605)。其cDNA全长为658 bp,编码109个氨基酸残基;其中成熟肽含有88个氨基酸残基,相对分子质量为9.8 kDa,等电点为8.49;一级结构含信号肽、半胱氨酸富集区和WAP结构域,二级结构主要由α螺旋和p折叠组成,属于Type Ⅰ型Crustin。2.揭示了 SpCrus7基因在青蟹不同发育阶段和成蟹各组织的表达特性。SpCrus7在胚胎发育期,转录水平呈上升趋势;蚤状幼体Ⅰ期到仔蟹Ⅰ期,转录水平先上升后下降,在蚤状幼体V期达到最高,且极显著高于其他幼体期(P=0.003);值得关注的是,在雄蟹中,阴茎的表达量明显高于其他组织,其次是眼柄;SpCrus7在雌蟹的纳精囊和生殖道中的表达量明显高于其他组织,纳精囊最高,其次是生殖道。3.揭示了 SpCrus7基因在交配前后的雌蟹性腺中的表达特性。SpCrus7的mRNA水平在交配前后的雌蟹纳精囊和生殖道中存在显著性差异,交配后显著上调且维持高表达水平,表明SpCrus7可能在青蟹的生殖系统中发挥了一定的作用。4.揭示了溶藻弧菌和LPS刺激下SpCrus7的诱导表达模式。SpCrus7基因在溶藻弧菌刺激12 h的雌蟹纳精囊中显著下调;在溶藻弧菌刺激的雌蟹生殖道中无显著性变化;在溶藻弧菌刺激的雄蟹阴茎中无显著性变化;在溶藻弧菌刺激12h的雄蟹眼柄中极显著上调;在溶藻弧菌刺激6h的雄蟹血中极显著上调;在LPS刺激24 h的雄蟹鳃中极显著上调。结果表明,青蟹的SpCrus7基因参与了机体的免疫应答过程。5.获得了 SpCrus7成熟肽的原核表达产物pSpCrus7,并阐明了其体外抗菌活性。pSpCrus7对溶壁微球菌(Micrococcu lysodeikticus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、藤黄微球菌(M.luteus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、弗式志贺氏菌(Shigella flexneri)具有杀菌作用,最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,)分别为 12-24μM,12-24 μM,24-48 μM,24-48 μM,2448 μM,24-48 μM;对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生长具有抑制作用。杀菌动力学曲线显示,pSpCrus7与金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌和弗式志贺氏菌分别共孵120 min、120 min、240 min和240 min,杀菌指数达100%。此外,pSpCrus7对受试细菌无凝集作用,对细菌的抗菌活性的热稳定性差,且易受Na+浓度的影响。6.揭示了合成肽SpCrus72242的体外抗菌活性。SpCrus722-42对藤黄微球菌、溶壁微球菌、谷氨酸棒杆菌、金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌具有杀菌作用,MIC 值分别为 12-24 μM,12-24μM,12-24μM,12-24 μM,2448μM,24-48 μM,其MIC值小于或等于pSpCrus7的MIC值。杀菌动力学曲线显示,SpCrus72-42与金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、谷氨酸棒杆菌分别共孵30 min、15 min、15 min、30 min杀菌指数达100%,相同菌株杀菌指数达100%所需时间较pSpCrus7短。说明合成肽SpCrus722-42的体外抗菌活性较pSpCrus7强。SpCrus722-42对受试细菌无凝集作用,对细菌的抗菌活性的热稳定性较好,但易受Na+浓度的影响。SpCrus722-42对昆虫细胞Sf9、High Five和人肾上皮细胞293T以及拟穴青蟹血细胞均无毒性,且不改变细胞形态。7.获得了 SpCrus7成熟肽的真核表达产物eSpCrus7,并阐明了其体外抗菌活性。eSpCrus7对溶壁微球菌、谷氨酸棒杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、施氏假单胞菌、弗式志贺氏菌均具有杀菌作用,MIC值分别为12-24 μtM,12-24μM,24-48 μM,24-48 μM,24-48 μM,24-48μM;对枯草芽孢杆菌的生长具有抑制作用。其MIC值比合成肽SpCras722-42的MIC值高,与原核表达产物pSpCrus7相似;eSpCrus7对枯草芽孢杆菌的生长具有抑制作用。真核表达产物eSpCrus7的抗菌活性较合成肽SpCrris722-42弱,与原核表达产物pSpCrus7相近。8.初步探索了 SpCrus7的抗菌机制。通过扫描电镜观察SpCrus722-42处理后的细菌,细胞完整性和微观结构都发生了明显的变化,菌体破裂,内容物流出;利用流式细胞荧光分选仪统计SpCrus722-42处理后的细菌,细菌细胞膜的通透性发生了改变;共聚焦显微镜观察pSpCrus7可定位到受试菌的表面;微生物表面多糖结合实验发现pSpCrus7能识别并结合LPS、肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)、葡聚糖(Glucan)、脂磷壁酸(Lipoteichoicacid,LTA),微生物结合发现pSpCrus7能与受试细菌结合。结果表明,SpCrus7可能结合到细菌表面,进而破坏细胞的完整性,致使内容物流出,细菌破裂死亡。但关于SpCrus7的抗菌机制还需深入研究。