恶性神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占颅内肿瘤的45%,其年发病率高达5/100,000左右,因其具有浸润性生长、侵袭性强、血供丰富等特征,导致其治疗十分困难,复发率高,死亡率高,预后较差。目前主要予以开颅手术切除为主、放化疗为辅的方式治疗,但疗效均欠佳,即使联合手术、放疗和化疗,其平均生存期也仅为初次诊断后12-15个月。因此,研究胶质瘤的发生、发展的分子机制,寻找胶质瘤治疗的新靶点,已成为近年来胶质瘤诊治中的热点之一,对于降低胶质瘤的发病率、复发率及死亡率有重要临床意义。恶性胶质瘤的发生、发展是一个极为复杂的过程,受环境、遗传、分子生物学改变等多因素的影响,其发病机理尚未完全明确。近年来,越来越多的研究表明,表观遗传修饰在人类肿瘤的发生、发展过程中发挥极为重要的作用。表观遗传修饰主要包含DNA的甲基化、组蛋白的甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和非编码RNA调控的染色质再修饰等,其中最重要的表观遗传修饰是DNA甲基化和组蛋白修饰。组蛋白修饰包括由组蛋白乙酰转移酶(histone aeetyltransferases, HAT)介导的组蛋白乙酰化以及由组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)介导的组蛋白去乙酰化。两者共同参与各种肿瘤基因的表达,决定着组蛋白乙酰化的程度,在细胞发生转化过程中,可因各种机制引起HDACs的过表达或者活性增强,从而导致组蛋白过度的去乙酰化,致使调控细胞周期、细胞增殖、侵袭、血管形成及凋亡等相关基因转录失衡,从而导致细胞的恶变。HDACs是一个非常庞大的家族,在真核细胞生物内,HDACs被分成4大类,共包括18种同工酶。其中,组蛋白去乙酰化酶1 (histone deacetylases-1, HDAC1)可能是这些同工酶中最重要的之一,与恶性肿瘤的发生、发展有着密切的联系,越来越多的研究表明,HDAC1在多种人类恶性肿瘤中存在过度表达,如乳腺癌,直肠癌及肺癌等,其异常表达与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭、血管生成以及预后不良等息息相关。既往研究表明,在部分恶性肿瘤细胞中,通过siRNA干扰敲除HDAC1可抑制细胞的生长及扩散,促进细胞凋亡,同时抑制其侵袭及转移能力。鉴于这些研究结果,HDAC1被认为是治疗恶性肿瘤潜在的药物靶点。以往的研究表明,肿瘤细胞的高度增殖、侵袭特性是恶性胶质瘤复发的主要原因,也是胶质瘤发生、发展进程中的重要生物学过程,与胶质瘤患者的预后有着密切的关系。肿瘤细胞的增殖、侵袭过程可能涉及多条信号通路的异常激活,这些信号传导通路的异常活化是多种恶性肿瘤的重要特征,在恶性胶质细胞瘤中,PI3K/AKT 和 MEK/ERK信号通路是这些信号通路中最常被异常激活的,且对胶质瘤的发生、发展进程产生着重要的影响。其中,PI3K/AKT信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一,参与调控多个重要的生物学过程,如细胞生存、增殖、分化、转录、翻译、新陈代谢及DNA修复等,通过调节下游多种效应分子的活化状态,在肿瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡等过程中发挥着重要作用。该信号通路常在胰腺癌、肾癌等多种人类恶性肿瘤中被异常激活。研究表明,PI3K/AKT信号通路在胶质瘤的发展中可能也发挥着至关重要的作用；且该通路被认为与胶质瘤对放化疗的抵抗有直接关联。因此,PI3K/AKT信号传导通路也被认为可能是治疗恶性胶质瘤的理想药物靶点。MEK/ERK信号通路是一条存在于真核细胞中高度保守的信号传导通路,其激活能引起蛋白激酶级联反应,将细胞外信号传递入细胞内,启动多种转录因子的转录,有研究指出,该信号通路也参与神经胶质瘤细胞的生存、增殖、侵袭、凋亡等进程中,但是,迄今为止,HDAC1在胶质瘤及正常脑组织中的含量表达差异不清楚；HDAC1在胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程中潜在作用及其分子机制尚不清楚；HDAC1介导的胶质瘤细胞增殖、侵袭是否也与PI3K/AKT及MEK/ERK信号传导通路的异常激活有关尚需要进一步研究。HDAC6是Ⅱ类HDACs家族的一个较为独特的酶,能影响细胞质非组蛋白的功能,在肿瘤生物学的各方面如细胞周期、细胞增殖、迁移、耐药性等发挥关键的调节作用；因此,HDAC6也逐渐成为恶性肿瘤治疗中极有吸引力的潜在靶点。HDAC6已被证实在多种恶性肿瘤组织中高表达,如肝癌、膀胱癌及乳腺癌等,但其在胶质瘤组织中的含量表达的研究较少,其参与调控胶质瘤细胞增殖的相关机制尚不明确。既往研究指出,TGF-β/SMAD信号通路在各种细胞生物学事件中也发挥着复杂而重要的作用,特别对恶性胶质瘤的发生、发展过程有着重要的影响。 TGF-β/SMAD信号通路的基本过程为：首先,TGF-β在细胞外与Ⅱ型TGF-β受体结合,接下来催化Ⅰ型TGF-β受体的磷酸化,从而引发SMAD2和SMAD3两个胞内蛋白的磷酸化,并进一步与SMAD4形成异聚复合物,然后活化的SMAD聚合物移位至细胞核,与其它转录因子共同调控相应靶基因的转录。同时,研究表明,SMAD7蛋白对SMAD2/3信号有抑制的作用,该蛋白已被证实是HDACs的一种直接底物,是细胞内Ⅰ型TGF-β受体的拮抗蛋白,能牢固地与Ⅰ型TGF-β受体相结合,使之无法催化SMAD2和SMAD3两个胞内蛋白的磷酸化,从而阻断信号转导过程。这表明HDACs可能参与调控TGF-β/SMAD信号传导通路,因此,我们猜测,作为HDACs家族重要的一员,HDAC6可能同样参与调控TGF-β/SMAD信号通路的传导,其可能通过调控该信号通路来影响恶性胶质瘤细胞的增殖。本研究中,我们首先检测了正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中HDAC1、HDAC6的表达水平,结果表明HDAC1、HDAC6在胶质瘤组织中较正常脑组织中表达增高,可望将HDAC1、HDAC6作为抗胶质瘤治疗的潜在靶点；接下来,我们分别研究了基因敲除或过表达HDAC1后恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力的变化以及使用HDAC6抑制剂(ACY-1215)抑制HDAC6后恶性胶质瘤细胞增殖能力的变化；最后,我们探讨了PI3K/AKT 和 MEK/ERK信号通路在HDAC1调控恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭过程中的作用机制,以及TGF-β/SMAD信号通路在HDAC6调控恶性胶质瘤细胞的增殖过程中的作用机制。第一部分组蛋白去乙酰化酶1在恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭中的作用及其机制第一章HDAC1在正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况目的探讨HDAC1在正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况。方法收集南方医科大学珠江医院、暨南大学附属第一医院、中山大学附属肿瘤医院71例手术切除的脑胶质瘤病理组织及12例癫痫颞叶切除及脑外伤内减压时切除的相对正常脑组织。采用免疫组化及RT-qPCR检测组织标本中HDAC1的蛋白及mRNA表达水平。采用t检验、单因素方差分析及卡方检验进行统计分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果胶质瘤组织中HDAC1的蛋白表达水平高于正常脑组织(P=0.03)；胶质瘤组织中HDA C1的mRN A表达水平高于正常脑组织(P=0.000),不同病理级别之间HDAC1的mRNA表达水平无差异(P=0.837),表明HDAC1 mRNA表达与脑胶质瘤的病理级别无相关性。结论HDAC1的蛋白及mRNA表达水平在胶质瘤组织中较正常脑组织中增高,提示HDAC1可能在胶质瘤的发生发展中发挥重要作用。第二章HDAC1影响恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程目的探讨基因敲除及过表达HDAC1能否对U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力产生影响。方法以胶质瘤细胞系U87MG为研究对象,分别采用小分子RNA(siRNA)干扰技术敲除HDAC1及质粒转染过表达HDAC1;利用Western Blot检测U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达情况；MTS增殖实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力,Ti answell侵袭实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的侵袭能力。采用t检验、单因素方差分析进行统计分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果siRNA干扰技术敲除HDAC1后,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达水平明显下降,提示转染成功,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力下降(P<0.05)；质粒转染过表达HDAC1后,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达增加,提示转染成功,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭能力增强(P<0.05)。结论HDAC1可对恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力产生影响,进一步证实了HDAC1在胶质瘤的发生、发展中发挥着重要作用,有望将其作为抗胶质瘤治疗的潜在靶点。第三章HDAC1通过调控PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路影响恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程。目的探索PI3K/AKT及MEK/ERK信号传导通路在HDAC1调控胶质瘤细胞增殖、侵袭过程中的作用及机制。方法以胶质瘤细胞系U87MG为研究对象,分别采用siRNA干扰技术敲除HDAC1及质粒转染过表达HDAC1,同时予以PI3K及MEK特异性抑制剂抑制相关信号通路。实验分组如下：siRNA干扰基因敲除HDAC1实验分为3组：正常组、干扰对照组、siRNA干扰HDAC1基因敲除组；质粒转染过表达HDAC1实验分为6组：正常组、过表达对照组、HDAC1过表达组、HDAC1过表达+PI3K抑制组、HDAC1过表达+MEK抑制组、HDAC1过表达+PI3K抑制+MEK抑制组。利用Western Blot检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表达情况；MTS增殖实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的侵袭能力。采用t检验、单因素方差分析进行统计分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果siRNA干扰技术敲除HDAC1后,干扰组U87MG恶性胶质瘤细胞HDAC1蛋白的表达水平明显下降,提示转染成功,干扰组U87MG恶性胶质瘤细胞中AKT、ERK总蛋白水平无变化,p-AKT、p-ERK蛋白水平下降,U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力下降；质粒转染过表达HDAC1后,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达增加,提示转染成功,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中AKT、ERK总蛋白水平无变化,HDAC1过表达组p-AKT、p-ERK蛋白水平升高,U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较正常组增强,HDAC1过表达+PI3K抑制组p-AKT蛋白水平下降、p-ERK蛋白水平无变化,U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较HDAC1过表达组下降,HDAC1过表达+MEK抑制组p-ERK蛋白水平下降,p-AKT蛋白水平无变化,U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较HDAC1过表达组下降,HDAC1过表达+PI3K抑制+MEK抑制组p-AKT、p-ERK蛋白水平下降,U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较HDAC1过表达组明显下降(P<0.05)。结论 HDAC1可能通过异常激活PI3K/AKT和MEK/ERK信号传导通路来调控恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭过程,本研究有望为恶性胶质瘤的治疗找寻到新的靶点及突破口。第二部分 组蛋白去乙酰化酶6在恶性胶质瘤细胞增殖中的作用及其机制第一章HDAC6在正常脑组织及恶性胶质瘤组织中的mRNA表达情况目的探讨H DAC6在正常脑组织及恶性胶质瘤组织中mRNA表达差异。方法收集南方医科大学珠江医院、暨南大学附属第一医院、中山大学附属肿瘤医院12例手术切除的脑胶质瘤病理组织及12例癫痫颞叶切除及脑外伤内减压时切除的相对正常脑组织,采用qPCR检测组织标本中HDAC1的mRNA表达水平。采用t检验进行统计分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果胶质瘤组织中HDAC6的mRNA表达水平高于正常脑组织(P<0.05),表明HDAC6 mRNA水平在脑胶质瘤组织中存在高表达。结论HDAC6在胶质瘤组织中较正常脑组织中表达增高,提示HDAC6同样可能在胶质瘤的发生、发展中发挥着重要作用。第二章HDAC6通过调控TGF-β/SMAD信号通路对恶性胶质瘤细胞的增殖过程产生影响目的探索TGF-β/SMAD信号传导通路在HDAC6调控胶质瘤细胞增殖过程中的作用及机制。方法以恶性胶质瘤细胞系A-172.U87MG为研究对象,分别利用HDAC6抑制剂(ACY-1215)抑制HDAC6及SMAD2磷酸化的诱导剂(重组人TGFβ1)加入各实验组中,实验分组如下：阴性对照组(无任何干预)、ACY-1215组(A-172、U87MG胶质瘤细胞中分别加入HDAC6抑制剂ACY-1215)、重组人TGFβ1组(A-172、U87MG胶质瘤细胞中分别加入重组人TGFβ1)；利用Western Blot检测各实验组A-172、U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC6、 SMAD2、p-SMAD2、p21蛋白的表达情况；MTT增殖实验检测各实验组A-172、U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力,探讨HDAC6能否通过激活TGF-β/SMAD相关的信号通路来调控胶质瘤细胞的增殖能力。利用软件SPSS16.0对实验数据进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析；P<0.05被认为差异有统计学意义。结果实验组加入HDAC6抑制剂ACY-1215后,Western blot实验结果表明实验组A-172、U87MG胶质瘤细胞中HDAC6蛋白的表达水平明显下降,抑制剂ACY-1215能显著提高SMAD2的磷酸化,以及提高后续的一种众所周知的细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂p21的表达量,重组人TGFβ1显著诱导SMAD2的磷酸化并能显著提高p21的含量,但并不影响HDAC6蛋白水平；同时,MTT增殖实验结果表明抑制HDAC6后能显著降低的胶质瘤细胞的增殖能力(P<0.05),重组人TGFβ1的干预作用可抑制恶性胶质瘤细胞的增殖能力(P<0.05)。结论恶性胶质瘤细胞的增殖能力可被HDAC6抑制剂(ACY-1215)显著抑制,HDAC6可通过抑制TGFβ/SMAD信号传导通路来促进恶性胶质瘤细胞的增殖,该研究有望为恶性胶质瘤的治疗找寻到新的治疗靶点。