研究背景：创伤性颅脑损伤(TBI)是影响人们健康及生活质量的一个常见因素,对其发病机制的研究一直是神经外科领域的热点。近年来,随着神经分子生物学、神经外科学、神经影像学和神经监护系统的发展,人们对颅脑损伤的研究也越来越深入。目前研究认大多数原发性TBI仅为部分性脑损伤,在之后数小时至数天内会出现许多继发性损害。大量的研究发现TBI可引起过度的细胞外谷氨酸盐沉积、细胞内钙超载、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活等,从而引起急性或迟发性的细胞死亡。脑损伤后最主要的病理学表现主要包括神经元细胞凋亡、小神经胶质细胞活化、星形胶质细胞增生,最后形成密集的星形细胞疤痕。所有这些颅脑损伤患者临床症状的出现可能同损伤后的神经修复和神经元细胞本身再生受抑制有关。目前,对于治疗颅脑损伤引起的神经功能障碍,世界上还没有统一的共识及积极有效的治疗方案。而颅脑损伤的临床治疗要想获得真正的突破,必须首先搞清楚损伤后的细胞生物学改变及其分子机制,从而对其进行早期的干预,从根本上解决这一难题。促分裂原应力激活蛋白激酶MSK1是一种新发现的主要位于细胞核内的蛋白激酶,其基因序列位于ERK1/2(细胞外信号调节激酶)或p38MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)基因的下游并可被其激活。MSK1由两个蛋白激酶的结构域构成,其氨基末端的结构域同AGC激酶家族相关,而其羧基端隶属于CaMK家族。其上游基因MAPK可磷酸化MSK1羧基端的结构域,当磷酸化完成时则可激活其氨基端的结构域。而活化的MSK1的氨基末端结构域就可以引起其底物的磷酸化。MSK1与其底物并没有精确的共有序列,但却对磷酸化的残基具有优先性。在细胞中,MSK1可以磷酸化多种底物,包括CREB(cAMP效应元件结合蛋白)、NFcB(核因子kB)、HMGN1和组蛋白H3。MSK1的主要的功能是调节IE基因,研究发现在去除MSK1的细胞中依赖CRE的IE基因的转录受到影响。关于MSK1具体的生理作用,目前世界上还没有统一的共识,但大量的的研究发现MSK1在一些先天性免疫系统疾病中发挥着重要的作用,并且它能够在重塑神经元细胞突触和调控细胞因子产生等方面起着一定的作用。随着研究的进行,MSK1的目靶数量在持续的增加,它除了可以调控基因的转录,还可以调节与细胞凋亡相关的蛋白质的翻译。最近的研究发现,MSK1在神经系统中高表达,但是对其在神经系统中的具体作用及机制,目前还没有统一的共识,MSK1是否在创伤性脑损伤中发挥作用及发挥何种作用,目前世界上还没有报道。为此,我们对MSK1在正常和外伤后脑组织中的表达变化及其在神经损伤和修复过程中的细胞分子机制进行了初步的探讨。研究目的：通过一种改良的脑创伤模型来研究MSK1在大鼠脑损伤后的表达变化规律及其产生的作用效果,并进一步在细胞水平探讨MSK1在颅脑损伤后发挥作用的分子机制。实验方法：健康雄性的S-D大鼠,随机分为手术组、假手术组和正常组。其中手术组以自制改良的打击器械模拟重力加速损伤模型,打击重锤自由落下,直接撞击硬膜,致大鼠右侧脑损伤。假手术组只打开骨瓣,不损伤硬膜,其余手术步骤同手术组。采用蛋白免疫印迹法检测脑创伤后组织中的MSK1、PCNA及Caspase-3的表达变化。利用免疫荧光法对MSK1在大鼠脑组织中的细胞定位情况进行分析。然后通过建立原代星形细胞的增殖模型及神经元原代细胞的凋亡模型,利用分子生物学方法过表达和干扰MSK1,最后通过CCK-8及免疫印迹法,研究MSK1在神经元细胞凋亡及星形胶质细胞增殖中发挥作用的分子机制。实验结果：1、自制改良的脑创伤模型能够很好地模拟脑损伤后的生理病理改变以自制改良的打击器械模拟重力加速损伤模型,打击重锤自由落下,直接撞击硬膜,致大鼠右侧脑损伤。损伤后大鼠脑组织能在大体及细胞水平发生明显的损伤后改变。2、MSK1在颅脑损伤后的表达变化我们采用了Western blot和免疫组化的方法来研究MSK1在TBI后的表达变化规律。MSK1的蛋白水平在正常脑组织表达较高,而在伤口周围的皮层组织中,12小时后其表达水平逐渐下降,在3天时降至最低,其后逐渐增加恢复至正常水平。除此之外,我们在对侧未行手.术的皮层组织中检测到的MSK1的表达没有受到外伤的影响而出现改变。为了验证我们的结果,我们将损伤后的脑组织行冰冻切片并应用免疫组化的方法研究了MSK1的表达变化。我们发现在外伤后3天的时候,MSK1在皮层损伤侧的染色明显的低表达(从120/mm2降到30/mm2),但是在正常的对侧,仍看到MSK1在较高的水平表达,这说明MSK1在伤侧和正常侧表达的变化规律与Western blot的结果是完全一致的。3、MSK1在外伤后大鼠皮层中与不同细胞标记物的共定位众所周知,在大脑皮层中,存在四种细胞,分别为：神经元细胞,星形胶质细胞,少突胶质细胞及小胶质细胞。为了进一步探讨MSK1为何发生改变及其改变是否与某种细胞具有特定的关系,我们运用免疫荧光双标的方法研究了MSK1在大脑皮层中的定位情况。结果显示,在损伤前后MSK1都只在神经元细胞及星形细胞中表达,而在少突胶质细胞及小胶质细胞都没有表达,这就预示着M SKI可能参与了神经元细胞及星形胶质细胞的生物学行为。4、MSK1与成年大鼠脑外伤后细胞增殖的关系大量的研究表明,在脑创伤后,星形胶质细胞大量的增殖,从而对创伤的脑组织进行疤痕修复。既然MSK1在星形胶质细胞中表达,那么它是否参与了它的增殖?我们首先用免疫印记的方法研究了MSK1与细胞增殖指标PCNA的表达变化关系,我们发现PCNA在外伤后第3天的时候显著的增加,并且一直持续到了第14天。有趣的是,这种表达变化与MSK1的表达变化呈负相关。为了研究这两者的关系,我们运用免疫荧光双染色研究了两者的关系。结果显示：在受伤后第3天,星形胶质细胞发生大量的增殖。而MSK1与PCNA具有共定位,这就说明MSK1可能参与了星形胶质细胞的增殖。5、MSK1与颅脑损伤神经元细胞凋亡的关系以前的研究表明,在脑创伤后,神经元细胞大量的凋亡,这也是脑损伤产生临床症状的首要原因。既然MSK1在神经元细胞中表达,那么它是否参与了它的凋亡?我们首先用免疫印记的方法研究了MSK1与细胞凋亡指标活化caspase-3的表达变化关系,我们发现活化caspase-3在外伤后第3天的时候显著增加,并且一直持续到了第14天。有趣的是,这种表达变化与MSK1的表达变化呈负相关。为了研究这两者的关系,我们运用免疫荧光双染色研究了两者的关系。结果显示：在受伤后第3天,神经元细胞发生大量的凋亡。而MSK1与活化caspa se-3具有共定位,这就说明MSK1可能参与了神经元细胞的凋亡。6、新生大鼠海马神经元细胞用谷氨酸盐损伤后的细胞活力分析用谷氨酸盐作用于新生大鼠的海马神经元细胞使其受到损伤,分别于损伤后的6h、12h、18h和24h检测各组细胞的活力(利用CCK-8检测),实验结果显示：新生大鼠海马神经元的细胞活力随着损伤时间的延长及谷氨酸盐浓度的增加,呈显著下降趋势,具有时间及浓度依赖性。7、MSK1在谷氨酸盐损伤体外培养的新生大鼠海马神经元细胞中的表达用谷氨酸盐损伤新生大鼠海马神经元细胞,然后以Western Blot方法评估MSKI的表达变化。在用谷氨酸盐损伤新生大鼠海马的神经元细胞过程中,MSK1的表达发生了变化。在正常培养条件下,MSK1的蛋白有表达。而当新生大鼠海马神经元细胞被谷氨酸盐作用后,MSK1蛋白的表达明显减少；8、MSK1在细胞中的表达对谷氨酸盐诱导的新生大鼠海马神经元细胞活力的影响为了研究MSK1与海马神经元细胞凋亡的关系,我们利用MSK1的过表达质粒(EGFP-N2-MSK1)和小干扰RNA (siRNA)质粒来干预新生大鼠海马神经元细胞中MSK1的表达情况,观察MSK1的表达变化对谷氨酸盐刺激后新生大鼠海马神经元细胞活力的影响。新生大鼠海马神经元细胞分别转染入过表达质粒和小干扰RNA质粒。转染24h后,用5mM的谷氨酸盐刺激新生大鼠海马神经元细胞,并分别于刺激后的3h,6h,12h和24h观察细胞活力的变化。利用CCK-8检测结果显示：MSK1表达增高可部分逆转由谷氨酸盐诱导的细胞凋亡,具体表现为细胞活力的部分恢复。相反,MSK1表达的下调则加重谷氨酸盐诱导的细胞损伤,具体表现为细胞活力的进一步减退。以上实验结果表明：MSK1在海马神经元细胞的损伤和恢复过程中发挥着一定的调节作用,可对神经元细胞起到保护作用。9、LPS对星形胶质细胞增殖的影响从大鼠的大脑皮层中分离出星形胶质细胞,传代培养后分别采用1u/1,10ug/1,100μg/1,1mg/1和10mg/1的LPS对其进行刺激,运用western blot方法检测Ki67和PCNA的表达情况,结果显示：与正常组相比,随着LPS浓度的增加,Ki67和PCNA的表达都明显上升。这就说明LPS能够刺激星形胶质细胞增殖。10、MSK1的表达影响LPS诱导的增殖反应为了进一步研究MSK1与星形胶质细胞之间的关系,我们同样利用MSK1的过表达质粒(EGFP-N2-MSKI)和小干扰RNA (siRNA)质粒来干预星形胶质细胞中MSK1的表达,观察干预前后LPS刺激细胞相关因子的表达情况。细胞经过培养、传代,分别转染入过表达质粒和小干扰RNA质粒。转染24h后,利用LPS刺激细胞,并在损伤后24h测定了细胞中Ki67和PCNA的表达情况。结果示：过表达MSK1可能抑制细胞的增殖；而干扰MSK1的表达后细胞增殖增强,表明MSK1可能抑制星形胶质细胞的增殖。结论：1、我们以自制打击器械模拟重力加速损伤模型,打击力度可控,打击准确性高,可操作性及可重复性良好。2、MSK1在大鼠颅脑损伤后的表达变化规律：MSK1在颅脑损伤12小时后其表达水平逐渐下降,在3天时降至最低,后逐渐恢复至正常水平。3、MSK1在大鼠脑外伤皮层中与神经元细胞及星形胶质细胞共定位。4、MSK1在蛋白水平的表达在大鼠脑外伤后发生了明显的变化,这种变化和caspase-3及PCNA的变化具有相反性。说明MSK1在大鼠脑外伤后细胞凋亡和增殖中可能发挥了一定的作用。5、MSK1被表达质粒(EGFP-N2-MSK)干扰后,在一定程度上逆转了谷氨酸盐诱导的新生大鼠神经元细胞的凋亡过程,而以小干扰RNA (siRNA)质粒干扰MSK1表达后细胞凋亡明显增加,说明MSK1可能具有抗凋亡的作用。6、脂多糖LPS刺激星形胶质细胞后其增殖因子Ki67和PCNA的表达增加,过表达MSK1后在一定程度上能抑制增殖因子释放；而干扰MSK1的表达后则促进了增殖因子的释放。这表明MSK1在一定程度上抑制了星形胶质细胞的增殖反应。7、大鼠脑外伤后的分子生物学变化与MSK1的生物学活性相关。