研究背景:药物筛选、体内代谢和药效机制研究是药物研发的重要环节,选择合适的研究模型能够有效地缩短研发周期,降低成本。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)因其简单完整的神经系统、特殊生理结构和易于造模等特点在药物筛选中得到应用,现已利用秀丽隐杆线虫筛选出具有治疗神经退行性疾病的作用中药成分如加兰他敏、海藻二塘、更年春等,但是筛选方法不够完善,常用的液体培养基存在一定局限性。目前秀丽隐杆线虫模型不仅应用于药物,也逐渐应用药物代谢机制和药物作用机制研究中,但是有关利用秀丽隐杆线虫模型进行化合物体内代谢的研究较少。本课题基于课题组前期对去氢骆驼蓬碱制备工艺研究并且发现骆驼蓬多糖对亨廷顿舞蹈症有一定的改善作用的基础上开展的。亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease,HD)是一种常染色显性遗传的神经退行性疾病,是多聚谷氨酰胺蛋白(polyQ)突变引起的。目前,关于polyQ导致神经细胞病变的机制尚不明确,临床常用药物多是缓解HD的临床症状,尚未有治愈HD的药物上市。从亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease,HD)发病机理来看,以polyQ蛋白为靶点药物筛选为治愈HD提供了可能。基于此,本课题以秀丽隐杆线虫模型筛选治疗HD药物为例完善筛选方法,以去氢骆驼蓬碱为例对中药成分在线虫体内代谢机制进行研究,并利用秀丽隐杆线虫polyQ模型对骆驼蓬多糖的活性与作用机制进行进一步的探讨。目的:完善利用秀丽隐杆线虫模型筛选治疗HD的中药有效成分的方法;以去氢骆驼蓬碱为例建立中药成分在线虫体内代谢的研究方法;利用秀丽隐杆线虫模型AM141对骆驼蓬多糖抑制polyQ蛋白聚集作用进行全面的评价;以骆驼蓬多糖为例探究秀丽隐杆线虫模型在药物作用机制方面的应用。方法:1.以药物的溶解度、线虫的生长状态、有无菌落生长及操作难易程度为评价指标,建立以固体培养基为培养载体,以线虫株AM141为筛选模型,以中药组分、中药多糖、中药单体为药物来源的药物筛选的方法,筛选有效抑制polyQ蛋白聚集的中药成分。将去氢骆驼蓬碱给予线虫AM141后,用甲醇:水(3:1)进行提取成虫的体内成分离心后注入液质联用仪,总结去氢骆驼蓬碱在电喷雾正离子模式下裂解规律,探究去氢骆驼蓬碱在线虫体内代谢机制。2.在建立的药物筛选的基础之上,采用秀丽隐杆线虫表型评价法(产卵、寿命和运动性能评价)和荧光漂白恢复法对骆驼蓬多糖抑制polyQ蛋白聚集的能力做全面评价,建立药效-浓度曲线,确定最佳给药浓度;将骆驼蓬多糖与不同生存状态的大肠杆菌E.coli OP50(活性、处死、37 ℃孵育)混合加药,探究骆驼蓬多糖在秀丽隐杆线虫模型中不同药效,利用UPLC-Q-TOF/MS技术分析骆驼蓬多糖在大肠杆菌E.coli OP50影响下的成分变化。3.将骆驼蓬多糖经三氟乙酸水解后,将分解后产物与单糖标准品分别与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化反应,将衍生化产物注入HPLC-MS分析,建立完善单糖衍生化产物的在电喷雾负离子模式裂解规律,分析骆驼蓬多糖的单糖组成。4.利用western blot和qRT-PCR技术探究骆驼蓬多糖对秀丽隐杆线虫模型体内polyQ蛋白和Htn基因的表达水平的影响;在此基础上利用不同秀丽隐杆线虫模型探究骆驼蓬多糖在线虫体内的作用机制。结果:1.在液体培养基中,除了中药水提取物外,其他提取部位均产生絮状沉淀,固体培养基无需考虑此问题;培养基孔径的选择,经过实践发现12孔板更适合于中药提取物的药效筛选。经过初筛,骆驼蓬多糖具有改变线虫株AM141的polyQ聚集表型的能力。去氢骆驼蓬碱在电喷雾正离子模式下主要发生甲基、CO、乙炔和亚胺基的丢失,裂解方式以RDA和α裂解为主;去氢骆驼蓬碱在线虫n1046(gf)体内代谢产物有m/z 229.0961和m/z 199.0857[M+H]+两个分子,分别是羟基化和去甲基化。2.经过给药骆驼蓬多糖,线虫株AM141体壁肌肉细胞中荧光点数量降低约30%,线虫株HA759头部ASH神经存活率也明显提高;线虫株AM141经过给药处理,产卵数量和身体弯曲次数均高于对照组,寿命无影响;骆驼蓬多糖与不同生存状态的大肠杆菌E.coli OP50混合加药,抑制率:37℃ 孵育>活性>事先处死,UPLC-Q-TOF/MS分析得知骆驼蓬多糖在细菌影响下被分解成水苏糖、毛蕊花糖和均六碳醛糖组成的三糖和四糖。3.单糖衍生物在电喷雾负离子模式下主要以α和β裂解为主,醛酸糖类单糖衍生化产物均出现m/z 244.8、m/z 172.7的碎片,六种还原性醛糖均出现m/z214.7、m/z 186.7碎片;骆驼蓬多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖组成。4.对线虫株AM141加药组和对照组的polyQ蛋白和基因表达进行归一化后,加药组的polyQ蛋白表达量低于对照组,基因表达量两组无明显差异;骆驼蓬多糖在线虫株OP683和VK1243均产生自发荧光对线虫的表型观察产生干扰,对线虫株DLM11的表型无影响。结论:本课题完善了秀丽隐杆线虫模型筛选治疗HD中药成分的方法,以去氢骆驼蓬碱为例完善了中药化合物在秀丽隐杆线虫体内代谢研究方法;利用建立的药物筛选方法得到能够显著抑制polyQ蛋白聚集骆驼蓬多糖,其能够抑制蛋白聚集带来的毒性,改善线虫的表型;经大肠杆菌E.coliOP50分解后骆驼蓬多糖的活性更好,通过液质联用技术和柱前衍生化法确认了多糖被细菌分解成水苏糖、毛蕊花糖和由均半乳糖醛酸组成的三糖和四糖;利用秀丽隐杆线虫模型对骆驼蓬多糖的作用机制进行初探,为药物作用机制研究提供了可行的思路,为秀丽隐杆线虫在中药筛选的广泛应用奠定基础。