研究背景和目的流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV,简称乙脑病毒)属于黄病毒科黄病毒属病毒,首次于1935年在日本从患者脑组织中分离获得(Nakayama病毒株,简称NAK),故又称日本脑炎病毒。乙脑病毒为单股正链RNA病毒,大小约为11 kb,只含一个长的开放阅读框架(open reading frame, ORF),编码3个结构蛋白(C蛋白、PrM or M蛋白、E蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5),分五个基因型(GⅠ、GⅡ、 GⅢ、GIV和GV)。常用的敏感实验动物是乳鼠,脑内接种乙脑病毒后3-4天发病,一周左右死亡,脑组织内含大量感染性病毒,是分离病毒、大量制备抗原的可靠方法。乳仓鼠肾细胞(Baby hamster syrian kidney cells,BHK-21)、白纹伊蚊细胞(A mosquito cells,C6/36)及鸡胚成纤维细胞则是常用的敏感细胞,病毒在这些细胞内增殖可引起细胞圆缩、颗粒增多及细胞脱落等。乙脑病毒所致的疾病为流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis B,JE,简称乙脑),又称日本脑炎。乙脑流行于热带及亚热带地区,经蚊媒传播,主要侵犯人及某些动物的中枢神经系统,是威胁人群特别是儿童健康的重要人兽共患传染病,其潜伏期一般在10-14天左右,在临床上主要表现为高热、剧烈头痛、恶心、呕吐及意识障碍等症状,重者可出现强直痉挛、惊厥及脑膜刺激征,甚至出现呼吸衰竭而死亡等。人被带毒蚊叮咬后,大多数呈隐性感染,只有少数人发病为脑炎,发病率一般在2/10-10/10万之间,但其病死率达20%～30%,且30%～50%的幸存者有神经系统后遗症。因此,乙脑是社会和家庭的巨大疾病负担,是重要的公共卫生问题。乙脑首先于1871年在日本被发现,随后扩展到了印度、巴基斯坦、中国、澳大利亚、新加坡等国家和地区,但其主要还是流行于亚洲东南部。我国是乙脑高发地区之一,全国除了青海以外的省、市均有乙脑病例的报道,在1957年、1966和1971年曾先后发生三次乙脑暴发流行,后两次发病人数分别高达15万和17万多,发病率达20/10万以上。20世纪80年代以后,随着对适龄儿童进行乙脑疫苗尤其是减毒活疫苗的接种,我国乙脑发病率有了较大幅度的下降,并长期维持在相对较低水平,但每年的病例数仍波动于10000例左右,而且局部地区时有暴发流行。野生鸟类和猪是乙脑病毒的主要储存宿主,猪还是扩增宿主,三带喙库蚊是主要的传播媒介,而人类是乙脑病毒的终宿主。另外,一些其他种类的脊椎动物也被证明可以自然感染乙脑病毒,其中包括蝙蝠。迄今为止,已经在蝙蝠体内检测、分离到80多种病毒,例如亨德拉病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、尼帕尔病毒,其中也包括乙脑病毒,所以蝙蝠已被认为是多种人畜共患病病毒的重要储存宿主。中国和日本的研究均表明在蝙蝠体内能检测到乙脑病毒和/或乙脑病毒的血清抗体。2008-2009年期间,本课题组亦从广东、海南及湖南的蝙蝠体内分离出4株乙脑病毒(GD1、HN2、YY87和YY158),其中GD1和HN2的全基因组序列已发表,均属于GIII型。我们课题组通过对比发现蝙蝠来源的乙脑病毒株(GD1和HN2)和人来源的乙脑病毒株(NAK)的核苷酸和氨基酸序列具有高度相似性,但是这些乙脑病毒株对蝙蝠的感染力(如毒力、免疫性反应等)是否存在差异尚不清楚。果蝠以水果为食,体型较大,易于饲养,与人类和蚊子关系密切,且曾有研究表明果蝠可通过人工注射途径而实验感染乙脑病毒。因此,为探讨人来源及蝙蝠来源乙脑病毒株对蝙蝠的感染性是否存在差异,我们选择果蝠为实验动物,进行了本实验。研究方法1.蝙蝠的捕获与处理分别于2013年6月和2014年6月,在广东和海南省部分地区捕获果蝠,捕获蝙蝠的地点主要为废旧房屋和公园棕榈树。怀孕和哺乳期的蝙蝠放生,其余的果蝠则带回实验室动物房饲养。每天喂养新鲜的水果(香蕉、番石榴、苹果和梨子等)。2.病毒株在实验中使用了1株人来源的乙脑病毒株(NAK)和2株蝙蝠来源的乙脑病毒株(HN2和GD1)。NAK病毒株为乙脑病毒原型株,于1935年从一个日本乙脑死亡病人脑组织中分离到,HN2病毒株于2008年分离自海南地区的长翼蝠,GD1病毒株于2009年分离自广东地区的大足鼠耳蝠。3株乙脑病毒在注射果蝠之前均通过BHK-21细胞进行病毒扩增,并分别计算其扩增后病毒液的半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose, TCID50)。3.蝙蝠感染乙脑病毒研究中包括了2个实验。实验一有8只果蝠,随机分成3组(NAK1, HN2-1和GD1-1组),其中NAK1组有3只果蝠(bat1,bat2和bat3),HN2-1组3只果蝠(bat4,bat5和bat6),GD1-1组2只果蝠(bat7和bat8)。三组果蝠分别在大腿根部采取皮下注射的方法注射0.1 ml NAK(10423 BHK-21 TCID50/0.1ml)、HN2(10524 BHK-21 TCID50/0.1ml)和GDI (105.86 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙脑病毒。实验二有11只果蝠,也随机分成3组(NAK2, GD1-2和NEG组),其中NAK2组4只果蝠(bat9, bat 10, bat11和bat12)、GD1-2组5只果蝠(bat13、bat14、bat15、 bat 16和bat17)。这两组果蝠分别皮下注射0.1 ml NAK (103.50 BHK-21 TCID50/0.1ml)和GD1 (10300 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙脑病毒。NEG组在实验中作为阴性对照,包括2只果蝠(bat18和batl9),大腿根部皮下注射0.1 ml不含病毒的细胞培养液。注射乙脑病毒前后,每天观察实验果蝠的临床表现并记录。采用割大腿的方式分别获取果蝠注射乙脑病毒前0天以及注射乙脑病毒后4天、14天、21天的血液。所有果蝠在注射乙脑病毒后21天处死,无菌解剖观察果蝠内脏变化情况,并取脑组织标本,保存在含有RNAlater的冻存管中,放入-80-C保存,待检。4.蝙蝠乙脑病毒的检测单层BHK-21细胞接种所有实验果蝠的血清样本,细胞染毒血清后,观察细胞病变时间≤7天。采用Roche High Pure viral RNA kit提取蝙蝠脑组织及血清病变细胞液的病毒RNA,用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成cDNA,以逆转录产物cDNA为模板,利用TaqMan Real time RT-PCR法检测脑组织和血清中的乙脑病毒。5.蝙蝠乙脑病毒抗体的检测采用间接ELISA和病毒中和试验两种方法对果蝠体内的乙脑病毒抗体进行检测。若ELISA IgG抗体检测阳性,则进一步进行病毒中和试验观察果蝠乙脑病毒中和抗体产生情况。间接ELISA方法是在商售JEV ELISA抗体检测试剂盒的基础上,进一步建立的蝙蝠JEV IgG抗体检测方法,也就是将购自武汉科前动物生物制品有限公司的猪JEV ELISA抗体检测试剂盒中的酶标二抗,更换为购自美国Thermo公司的Recombinant Protein A/G, Peroxidase Conjugated。病毒中和试验则主要参照中华人民共和国卫生行业标准(WS214-2008)操作步骤进行。6.病理学检查将实验果蝠脑组织样本制成病理切片,显微镜下观察果蝠脑组织病理变化情况。7.质量控制1)移液枪头、冻存管、EP管等实验耗材均为一次性用品；2)RNA的提取和逆转录所用的容器和配制试剂如移液枪头、EP管等,均事先用DEPC水处理,且仔细操作,防止环境中RNA酶的污染；3)细胞培养的所有操作均在细胞培养间的超净台内进行,防止污染；4)果蝠的解剖在无菌间生物安全柜进行,全程做好个人防护工作；5)实验过程严格设立阴、阳性对照及空白对照；6)果蝠的血清采集和保存过程严防细菌污染。结果1.蝙蝠临床表现实验一和实验二中的果蝠在注射乙脑病毒前后均未出现任何典型的乙脑临床症状,身上也无任何受伤的痕迹,毛色正常。果蝠进食状况良好,无异常表现。在无菌解剖时,果蝠内脏有轻微缺血表现。2.蝙蝠病毒血症检测结果所有的果蝠血清样本均通过BHK-21细胞进行了病毒增值。在实验一中,细胞可见到明显的病变效应(cytopathic effect, CPE),主要有细胞变圆、细胞间隙增宽以及细胞脱落等。实验一中的大多血清样本(7/13)通过TaqMan Real time RT-PCR检测乙脑病毒阳性,且三个注射组间检出率相似。实验二中的所有果蝠均未检测到病毒血症。3.蝙蝠脑组织乙脑病毒检测结果利用TaqMan Real time RT-PCR法对实验一和实验二中果蝠脑组织标本进行乙脑病毒检测,结果实验一中所有果蝠脑组织标本(除了HN2-1组的bat5)均乙脑病毒检测阳性,而实验二中所有果蝠脑组织标本均为阴性。4.蝙蝠ELISA检测结果实验一和实验二的所有注射病毒的果蝠血清均检测到了抗乙脑病毒IgG抗体,提示果蝠对来自人型和蝙蝠型的乙脑病毒株都可产生免疫反应。实验一的果蝠在感染乙脑病毒第4天时乙脑病毒IgG抗体阴性,后全部转为阳性；实验一和实验二的果蝠均在感染乙脑病毒第14～21天左右产生乙脑病毒抗体高峰。5.蝙蝠乙脑病毒中和抗体检测结果对所有感染乙脑病毒的实验果蝠的21天血液进行病毒中和试验,结果15个ELISA检测阳性的标本中有14个病毒中和试验阳性(阳性率93.3%),只有GD1-2组的bat14为阴性。实验一的中和抗体滴度均高于实验二的中和抗体滴度(1：23.41～1：56.30 vs.1：5.00～1：15.87,t=-5.733,P<0.001)。6.蝙蝠脑组织病理检查结果实验二中NAK2和GD1-2组的果蝠脑组织均大体结构正常,但可见轻微的炎症反应,包括轻度的血管充血、水肿、淋巴细胞侵润等。实验一果蝠脑组织未进行病理学检查。总结1 果蝠对人来源(NAK)及蝙蝠来源(HN2和GD1)的乙脑病毒株均易感,且均为无症状感染,提示乙脑病毒已经适应果蝠。2 人来源(NAK)和蝙蝠来源(HN2和GD1)乙脑病毒株对果蝠的感染力、毒力相似,且果蝠对3株病毒的免疫反应性亦相似。3 果蝠感染不同浓度的乙脑病毒后,均可产生血清抗体。而且,中和抗体的滴度与感染浓度存在剂量反应关系。4 实验一果蝠感染乙脑病毒后,血清和脑组织样本均检测到乙脑病毒,但病毒载量很低,实验二则未检测到病毒,提示乙脑病毒对蝙蝠的感染力与病毒浓度相关。