论文部分内容阅读
人口问题是我国经济可持续发展的重要因素,因此避孕节育研究受到极大的重视。近年来,人类附睾蛋白酶抑制剂Eppin成为男性避孕研究中重要的候选物。人附睾蛋白酶抑制剂(Epidydimal protease inhibitor,Eppin)为分泌蛋白,在结构上包含Kunitze和Wap两个结构域,主要在男性的附睾及睾丸中特异性表达。O’Rond等人于2004年的动物实验中使用重组Eppin蛋白免疫雄猴,获得78%的不育率,抗体高滴度维持数月后下降,72%雄猴恢复了致孕功能;随后的研究发现在射精的过程中Eppin蛋白与精子凝固蛋白(Semenogelin,SEMG1)结合后调控来自前列腺的前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)专一水解SEMG1,并延缓其水解,使得精子处于凝胶保护中,维持精液微环境,免受女性阴道环境的攻击,保证精子正常液化后获能。同时有研究表明Eppin与SEMG1结合能减慢精子运动能力。抗Eppin抗体可能与SEMG1类似,特异性结合Eppin后由于PSA不能水解抗体,精子运动将永久性被抑制,从而导致免疫性不育。两者结合位点所引起的构象改变可能是其抗生育作用的机制。研究Eppin蛋白的三维结构,解析其构象改变的分子基础将为筛选出具有研发避孕疫苗潜能物提供重要条件。本课题拟表达足量可溶性Eppin重组蛋白为蛋白结晶做准备。第一部分分析了Eppin蛋白的氨基酸序列,并对二级结构和二硫键配对进行预测。第二部分使用真核昆虫杆状病毒及果蝇S2表达体系表达Eppin蛋白。第三部分利用多种表达载体/宿主菌组合进行原核表达,在最佳诱导温度、诱导剂浓度以及蛋白破碎方式上做了探索。最后以带有麦芽糖结合蛋白MBP标签的方式,借助表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)低温诱导表达出首例可溶性Eppin蛋白。为获取大量、纯度高、可溶的Eppin蛋白,我们对pMALc质粒进行改造,加入了TEV酶切位点以及在TEV与Eppin基因序列之间增加用于纯化的组氨酸序列以加强酶切效率。蛋白纯化方式包括了Ni柱、Amylose柱以及分子筛亲和层析。实验结果如下:1、Eppin蛋白的N端有具有柔性的无规则曲卷loop区,相对C端较无序;预测将形成7对二硫键,分别为33-65、40-60、48-61、54-69、77-127、86-110、102-123。2、Eppin蛋白在昆虫Bac-to-Bac杆状病毒系统中以包涵体的方式表达于细胞内。果蝇S2则无表达。3、成功构建多个重组质粒pET22b-Eppin、pET40b-Eppin、p ET28a-Eppin、pET32M-Eppin、p ET15a-Eppin,诱导表达后Eppin蛋白均表达为包涵体。4、成功构建pMALc-2x-Eppin重组质粒,表达可溶性重组MBP-Eppin蛋白,去除标签后获得首例可溶性Eppin蛋白,质谱分析证实为Eppin蛋白,具有抗原性。5、可溶性Eppin蛋白以多聚体状态与MBP共纯化,用于Ni柱纯化的组氨酸标签未暴露。全长表达可溶性表达存在困难,后续研究可考虑以C端一部分序列作为蛋白结晶的研究。本研究对如何获得可溶性Eppin蛋白进行了大量的实验探索,同时也获得了首例可溶性Eppin蛋白,为研究其三维结构的测定及筛选出具有研发避孕疫苗潜能物提供重要实验基础。