原肠胚时期是斑马鱼早期胚胎发育过程中一个非常重要的时期,该时期各个胚层受各种信号的调控分别获得各自的发育命运。近年来,外胚层和中胚层的发育过程及其分子调控机制已经研究的比较深入,但对内胚层的发育和调控却知之甚少。本文以斑马鱼为模式动物,成功构建了能够在原肠胚时期特异性标记内胚层的转基因斑马鱼系sox17:Kaede及sox17:Zebrabow。sox17是内胚层发育过程中一个极其重要的转录因子,sox17缺失表达将会导致内胚层发育异常,以sox17作为启动子驱动可变色的绿色荧光蛋白Kaede和红色荧光蛋白Zebrabow来追踪内胚层细胞的分化命运是可行的。荧光蛋白Kaede在紫外光辐照下会变成红色,这为追踪内胚层单细胞的分化命运提供了一个很好的思路。Zebrabow是基于Cre/Loxp系统建立的一种用于细胞示踪的复合式标记系统,利用该系统经他莫西芬处理后可以使临近细胞在Cre重组酶的随机作用下表达不同颜色的荧光蛋白,该系统的应用可以使标记细胞的定位更精确,并且被标记细胞的后代仍能持续表达荧光蛋白。该系统的建立细胞谱系追踪技术上的一次重大进展,将为进行精确地和长期地细胞谱系追踪创造良好的条件。肝脏是人体最重要的消化器官,对维持人体的健康起着举足轻重的作用,近年来对肝脏发育的分子机制已经研究得比较深入,但肝脏再生的诸多问题却不甚了解。胆管是肝脏重要的组成部分,胆管的正常形态和功能对肝脏维持其正常生理功能十分重要。近年来的研究表明,胆管细胞具有分化的潜能,在某些病理条件下能够进行转分化形成其他类型的肝细胞来进行肝脏的修复。本实验构建了标记胆管的转基因鱼系Tp1bglob:Zebrabow来研究在肝脏受损的情况下胆管细胞的行为,以期明确胆管是如何进行肝脏修复的。本实验首先构建了 pBS-soxl7-Kaede、pBS-sox17-Zebrabow 和pBS-Tp1bglob-Zebrabow的重组转基因质粒,三种转基因鱼的构建均基于I-SceI转基因系统。在斑马鱼胚胎发育的单细胞时期注射0.15ng转基因质粒到动物极中,待注射转基因质粒后的斑马鱼长成成鱼后,我们将利用荧光显微镜对F0进行筛选,将表达模式和荧光强度符合我们期望的转基因鱼进行饲养并持续传代,待传代至F2时,若转基因鱼的表达模式以及荧光强度均符合我们的要求,此时认为该转基因系可以稳定遗传,即完成了转基因斑马鱼系的成功构建。本实验中构建的转基因鱼sox17:Kaede和Tp1bglob:Zebrabow均在启动子驱动部位有比较好的表达,荧光强度也符合我们的要求。其中sox17:Kaede内胚层时期的单细胞可在紫外光辐照下变成红色,该转基因系在各方面均符合我们的要求,可用于进行斑马鱼早期内胚层谱系追踪的研究,Tp1bglob:Zebrabow虽在表达模式和强度上符合我们的要求,但在本研究的初期探索实验中该复合式标记系统并未能工作,不能对胆管细胞进行复合式的标记,随后对导致该问题的原因进行了排查,但未能找到原因。转基因系sox17:Zebrabow在表达模式上出现了非特异性表达,但该非特异对追踪实验的进行影响不大。实验中该转基因系与sox17:CreER2杂交的后代经他莫西芬处理后能够在内胚层时期多层次地标记内胚层细胞,并且在后续的追踪实验中能够追踪变色细胞的发育命运,,因此我们也认为该转基因系可用于进行内胚层细胞的谱系追踪研究。