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醛糖还原酶(AldoseReductase)是醛酮还原酶超家族中的一员。它催化葡萄糖还原为山梨醇,通过减少内源或外源性代谢产物而起到解毒作用。已经明确AR与糖尿病并发症有密切关系。一些研究发现AR基因在大鼠原发性肝癌中高水平的表达,提示在快速生长的癌细胞中,AR参与了有毒代谢产物的解毒作用。醛糖还原酶相似基因(AldoseReductaselike-1,ARL-1)是1998年曹德良博士等在研究AR与人类原发性肝癌的关系时发现的一种新的基因。他们克隆并确定了该基因的cDNA序列和基因结构,发现ARL-1与AR相似,均以NADPH为辅酶,能还原各种醛类和糖类化合物。Northernblot显示,ARL-1在54%的原发性肝癌组织中呈高水平表达,而在正常肝组织中检测不到该基因的表达,提示ARL-1基因可能与肝癌的发生有关。
ARL-1是一个新的基因,其功能及与肝癌的确切关系目前尚不清楚,为了明确ARL-1在肝癌中的作用,我室在国内首先表达并纯化出两种ARL-1重组蛋白ARL-GST和ARL-(His)6,制备了抗ARL-1多克隆抗体,对ARL-1蛋白与肝癌的关系进行了初步研究。
由于多克隆抗体特异性差,存在交叉反应,本实验用纯化的ARL-GST重组蛋白免疫6-8周雌性Balb/c小鼠,按常规方法融合,间接ELISA法筛选,在3次有限稀释克隆化后,得到一株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,命名为F9。将此杂交瘤细胞株传代扩增,注射Balb/c小鼠制备腹水,并进行纯化。单抗鉴定结果表明:F9的亚型为IgG2b,轻链属于κ型;F9的腹水效价为1:4.096×105;F9只与ARL-GST纯化蛋白起反应,与AR-GST纯化蛋白无交叉反应。
本研究以此单克隆抗体为工具,应用Westernblot的方法检测ARL-1蛋白在几种相关组织中的表达情况;应用免疫沉淀的方法检测肝癌细胞系中ARL-1蛋白的表达;应用免疫组化的方法检测肝癌组织及细胞系中ARL-1蛋白的表达及定位情况。研究结果表明:ARL-1蛋白在正常成人组织中的表达主要位于小肠组织中,在结肠及胎盘组织中未检测到ARL-1蛋白的表达;在胎儿肾、肺、肝、脑等组织中未检测到ARL-1蛋白的表达;ARL-1蛋白在肝癌组织中的表达高于相应癌旁组织。应用免疫沉淀试验发现:ARL-1蛋白在肝癌细胞系7721中有表达。进一步应用免疫组化染色的方法发现:ARL-1蛋白在肝癌组织中表达较强,在癌旁组织中弱表达或不表达,在正常肝组织中表达量很低。ARL-1蛋白在细胞系中的表达情况为:在两株肝癌细胞系7721和HepG2中ARL-1蛋白表达较强,一株肝癌旁细胞系QSG中ARL-1蛋白表达较弱。
以上结果提示:F9为针对ARL-1蛋白的高度特异性单克隆抗体;ARL-1蛋白在肝癌中可能存在特异性的高表达。这将为进一步研究ARL-1蛋白与肝癌的关系、肝癌血清标志物的研究奠定基础,为今后进行大规模流行病学调查提供可能。