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Ras蛋白是原癌基因ras的表达产物,是一种GTPase开关蛋白,参与人类肿瘤的发生发展。Ras过度激活导致其下游的有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号级联过度激活。Ras/MAPK通路的过度激活与约30%的人类肿瘤密切相关,并且经常伴随着活性氧(reactive oxygen species,ROS)的过度累积。因此,开发下调Ras通路过度激活抗肿瘤药物的可行策略之一是筛选能够降低ROS含量的候选物。在秀丽隐杆线虫中,let-60基因与哺乳动物ras基因是同源基因,MT2124株系线虫let-60过度激活,在线虫中表现为不正常的肿瘤样多假阴门表型。前期研究发现生脉散具有显著的体内外抗氧化作用。故本研究采用秀丽隐杆线虫MT2124[let-60(gf)/ras]作为肿瘤模型,检测生脉散水煎剂(Shengmai-water decoction,SM-WD)是否可抑制Ras/MAPK通路过度激活及其可能的作用机制。本研究中测得1mg/mL生药量(以下浓度均为生药量)的SM-WD的体外抗氧化功能相当于0.0792mM的维生素E类似物Trolox。并且3.0~12.0 mg/m L SM-WD可浓度依赖地抑制Ras/MAPK通路的过度激活。因此,我们推测SM-WD可能是通过其体外抗氧化作用来发挥抑制Ras/MAPK通路的过度激活。但继续研究发现,3.0~12.0 mg/mL的SM-WD可浓度依赖地增加秀丽隐杆线虫MT2124[let-60(gf)/ras]突变体的脂褐素累积,12.0 mg/m L SM-WD处理MT2124[let-60(gf)/ras]突变体的体内总ROS水平和线粒体内超氧阴离子(O2·-)水平较空白对照组分别升高约90%,100%。说明SM-WD在MT2124[let-60(gf)/ras]突变体体内确实诱导了氧化胁迫,而非预期的抗氧化作用。为了研究SM-WD在MT2124[let-60(gf)/ras]突变体体内的作用机制,采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)清除ROS,及促氧化剂百草枯(Paraquat,PQ)诱导ROS的产生,以此来观察ROS水平对SM-WD抑制Ras过度激活作用的影响。结果显示,2.5 mM NAC可完全抵消12.0 mg/m L SM-WD抑制Ras/MAPK通路过度激活的作用,而0.5 mM PQ不能,提示SM-WD对Ras/MAPK通路过度激活的抑制作用并非依赖于其抗氧化作用。此外,采用外源添加150U超氧化物歧化酶(SOD)清除MT2124[let-60(gf)/ras]突变体体内O2·-,发现SOD显著抵消了12.0 mg/m L SM-WD约80%的作用,说明单独PQ具有与生脉散类似的功效,故SM-WD抑制Ras过度激活中,ROS和O2·-发挥着重要作用。本文还检测了SM-WD对MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫的线粒体功能的影响。结果表明:12.0 mg/mL SM-WD升高了MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫的耗氧量、线粒体丰度和游离钙离子水平,降低了体内ATP含量和线粒体膜电位,干扰线粒体呼吸链细胞色素C还原酶的cyc-1基因,可部分抵消SM-WD抑制Ras/MAPK通路的过度激活。结果提示SM-WD可通过调节线粒体的功能抑制Ras的过度激活,并且该抑制作用需要cyc-1的参与。NAC和PQ不影响SM-WD诱导耗氧量的增加、ATP含量减少和线粒体丰度增加,说明SM-WD并非是一个简单的促氧化剂,而是调节了线粒体的功能来诱导ROS的产生。本文采用线粒体通透性转换孔(Permeability transition pore,PTP)的其中一个亚基亲环蛋白D(CypD)的特异性抑制剂5μM环孢素A(CsA)处理MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫,发现CsA可完全抵消12.0 mg/mL SM-WD降低线粒体膜电位,诱导的O2·-、ROS水平的升高及其抑制Ras过度激活的作用,而PTP的另外两个亚基腺嘌呤核苷酸移位酶(ANT)和电压依赖性阴离子通道(VDAC)的特异性抑制剂米酵菌酸(BA,8μM)和4,4’-二巯基反苯代乙烯基2,2’-二磺酸二钠盐水合物(DIDS,500μM)没有这种抑制作用。其次,采用抗氧剂NAC清除ROS后,不影响SM-WD诱导的PTP的开放。结果提示,SM-WD是通过调节CypD促使PTP开放,PTP的开放增加了ROS的累积,引起氧化胁迫,最终抑制了Ras的过度激活。本文结果显示SM-WD还可浓度依赖地显著诱导MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫生殖腺细胞的凋亡。P53,JNK/MAPK和p38/MAPK这三条通路均与氧化胁迫相关,并且参与细胞的增殖等过程。因此,本文采用RNAi技术干扰cep-1(p53同源基因),jnk-1(JNK同源基因),pmk-1(p38同源基因),探讨这三条通路是否参与SM-WD对Ras过度激活的抑制。结果表明,分别干扰cep-1,jnk-1,pmk-1基因后都部分抵消了12.0 mg/mL SM-WD对Ras过度激活的抑制作用。并且12.0 mg/m L SM-WD可显著抑制ERK和p-ERK的表达,促进CEP-1、JNK、p-JNK和p38、p-p38的表达,并且CEP-1、JNK和p38均促进了12.0 mg/mL SM-WD对ERK和p-ERK的抑制作用,说明SM-WD对Ras过度激活的抑制需要P53,JNK/MAPK和p38/MAPK这三条通路参与。最后,本文研究还发现3.0~12.0 mg/mL SM-WD可浓度依赖地诱导野生型背景线虫的DAF-16核转位,其下游的GST-4、SOD-1、SOD-3、HSP-16.2的表达水平也显著升高。说明在野生型背景下SM-WD显著诱导了抗氧化系统的激活。综上所述,本研究发现SM-WD在Ras过度激活的背景下可通过调节CypD诱导PTP开放,诱导氧化胁迫,最终抑制Ras/MAPK通路的过度激活抗肿瘤。这些研究结果为SM-WD作为潜在的抗肿瘤药物候选物提供了新的数据资料。