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虾青素（Astaxanthin,AX）是广泛存在于海洋动植物体内的一种类胡萝卜素,具有抗肿瘤、增强免疫功能、改善心血管疾病等功能。研究表明,虾青素能通过提高细胞的抗氧化能力和影响自噬水平来发挥保护神经系统的作用,但其作用机制尚未完全阐明。自噬（Autophagy）是细胞通过结合溶酶体或其他具有酶解作用的囊泡,降解自噬泡中的细胞器和胞质蛋白,从而维持细胞内代谢及物质更新的过程。自噬在多种生理病理反应中发挥作用,包括在神经退行性疾病中扮演重要角色。线粒体作为细胞产能的主要场所,其稳态平衡可以依赖于一种受损线粒体清除机制即线粒体自噬。本实验采用大鼠嗜铬瘤细胞PC12和人脑星形胶质瘤细胞U87MG,以β-淀粉样蛋白片段Aβ25-35为诱导剂建立神经细胞损伤模型,研究在神经细胞损伤模型中虾青素的保护作用及其机制,以及在此过程中自噬发挥的作用。目的:1.研究虾青素对神经细胞损伤模型的保护作用及机制;2.初步探讨自噬以及线粒体自噬在虾青素保护神经细胞过程中的作用。方法:1.神经细胞损伤模型建立（1）采用大鼠嗜铬瘤细胞PC12和人脑星形胶质瘤细胞U87MG,Aβ25-35为诱导剂建立神经细胞损伤模型。2.虾青素的保护作用（1）MTT法确定AX用药浓度;（2）Hochest染色检测细胞凋亡;（3）Western blotting检测神经细胞标志蛋白GAP43和TUBB3表达;（4）检测细胞中过氧化物相关酶系统SOD、GSH-Px活力和MDA含量;（5）检测细胞内活性氧ROS的含量;（6）Western blotting检测氧化相关蛋白p62和NRF2表达;（7）Western blotting检测线粒体相关蛋白AMPK、TOMM20和Mitofusin 2表达;（8）免疫荧光检测线粒体标志蛋白。3.自噬在虾青素保护中发挥的作用（1）Western blotting检测自噬相关蛋白LC3Av1,LC3B,p62和Parkin的表达水平;（2）使用自噬抑制剂3-MA后检测细胞活力;（3）免疫荧光检测线粒体自噬;（4）电镜观察自噬泡与线粒体等亚细胞结构;（5）Co-IP检测LC3B和Parkin蛋白的相互作用。结果:1.神经细胞损伤模型建立MTT结果显示:随着Aβ浓度升高,细胞活力逐渐下降。2.虾青素的保护作用（1）MTT结果显示:与Aβ模型组相比,随着虾青素浓度的升高,细胞活力逐渐升高。确定虾青素用药浓度为0.1μM、1μM、10μM;（2）Hoechst结果显示:AX抑制了Aβ引起的细胞凋亡;（3）Western blotting结果显示:与Aβ模型组相比,AX保护组中神经细胞标志蛋白GAP43和TUBB3的蛋白表达水平均升高,提示AX对细胞有保护作用;（4）酶学检测结果显示:与对照组相比,模型组细胞的SOD和GSH-Px酶活力显著降低,MDA含量升高;AX预处理细胞24h后抑制了Aβ对细胞的损伤作用;（5）细胞中ROS检测结果显示:Aβ模型组中ROS合成增多,大量聚集;AX组ROS含量明显下降;（6）Western blotting结果显示:与对照组相比,Aβ处理细胞24小时后,p62表达水平显著降低,磷酸化p62表达水平升高,核内NRF2表达水平升高;AX预保护细胞24小时后,与模型组相比,p62、磷酸化p62与核内NRF2表达水平均升高;（7）Western blotting结果显示:与对照组相比,Aβ处理细胞24小时后,TOMM20、Mitofusin 2和磷酸化AMPK表达水平显著下降;AX预保护细胞24小时后,与模型组相比,TOMM20、Mitofusin 2和磷酸化AMPK表达水平升高;（8）免疫荧光结果显示:在Aβ模型组中TOMM20表达较低,说明正常结构的线粒体数量少;在AX组中,TOMM20表达升高,说明正常线粒体数量较多。3.自噬在虾青素保护中发挥的作用（1）Western blotting结果显示:与对照组相比,Aβ处理细胞24小时后,LC3Av1-Ⅱ型和LC3B-Ⅱ型表达水平显著升高,p62表达水平降低,Parkin表达水平升高;AX预保护细胞24小时后,与模型组相比,LC3Av1-Ⅱ型和LC3B-Ⅱ型表达水平降低,p62表达水平升高;（2）自噬抑制剂3-MA处理细胞后,MTT结果显示:与对照组相比,3-MA组细胞活力无明显变化。在Aβ模型组中,不管是否使用3-MA,细胞活力均相对对照组降低。AX组中,无3-MA处理,细胞活力逐渐升高;使用了3-MA的细胞,细胞活力维持在较低水平;（3）免疫荧光法检测线粒体自噬,结果显示:模型组LC3B表达显著升高,Parkin表达升高,表现为点状聚集增多,在胞质中呈弥散分布;与模型组相比,AX保护组中观察到LC3B点状聚集减少,表达降低;Parkin聚集增加,表达升高;（4）电镜结果显示:在Aβ模型组中,自噬泡数量增多,受损线粒体数量增多;在AX组中,自噬泡数量减少,正常结构的线粒体数量增多;（5）Co-IP结果显示,LC3B和Parkin并没有直接作用关系。结论:在Aβ25-35诱导的神经细胞损伤模型中,AX通过促进p62磷酸化,使NRF2入核激活细胞抗氧化反应,增强抗氧化酶系统活性,提高ROS清除能力,维持线粒体稳态,从而增强了神经细胞抵抗Aβ的能力。AX通过增强细胞抵抗Aβ的能力,降低了细胞总的自噬水平,在低的自噬水平下,AX增强了线粒体自噬,从而促进了受损线粒体的清除,维持神经细胞正常状态、降低神经细胞受损程度。